局灶性腦缺血預處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后腦紅蛋白的表達及意義

劉勁睿,陳梓桂,張明石

(1.佳木斯大學附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科,黑龍江 佳木斯 154003;2.佳木斯大學2007級研究生,黑龍江 佳木斯 154007)

近年來研究表明[1],缺血后的血流恢復在某些情況下能導致進一步的組織損傷和功能障礙,這種恢復血流灌注后的有害情況稱為缺血再灌注損傷(IRI),抑制再灌注損傷成為目前治療缺血性腦卒中的關鍵環(huán)節(jié)。缺血預處理(IP)這一概念是由 Murry[2]在1986年研究犬心肌缺血再灌注損傷實驗中首次提出的,近年研究發(fā)現(xiàn)缺血預處理可以提高組織對缺血損傷的耐受性。本研究采用大鼠右側大腦中動脈二次線栓法制備 SD大鼠的預缺血一再灌注一缺血一再灌注在體模型,利用 T TC染色 ,HE染色 ,免疫組織化學技術 ,觀測大鼠腦缺血再灌注損傷后不同時間段的大腦皮質(zhì)腦紅蛋白變化,旨在探討腦損傷后大腦皮質(zhì)腦紅蛋白隨時間變化的規(guī)律,以期完善腦缺血耐受機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

健康成年 SD大鼠90只,雌雄不限,2～ 3月齡,體重 230～250g,由佳木斯大學實驗動物中心提供,隨機分為假手術組(A組),缺血再灌注組 (B組),預處理缺血再灌注組(C組),每組取缺血再灌注 2h、8h、 24h、 48h、 96h5個時間點 ,分成 5個亞組,每個亞組6只老鼠,共90只大鼠。

1.2 動物模型制備

本研究參照 Longa等[3]和郝玉曼等[4]線栓法改進而來的大鼠右側大腦中動脈二次線栓法制備的 SD大鼠的預缺血一再灌注一缺血一再灌注在體模型,具體操作如下:SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3mL/100g)麻醉后,頸部正中切口,暴露頸總動脈(CCA)及分叉部,注意勿傷迷走神經(jīng) ,逐步分離頸外動脈(ECA)、頸內(nèi)動脈(ICA),在頸外動脈近端備線,在頸總動脈和頸內(nèi)動脈下方各穿一提拉線以暫時阻斷血流,在頸外動脈結扎線近端距分叉5mm處以頭皮針穿刺的方式導入直徑0.235mm、長5cm尼龍絲線,插入端用火燒圓并涂以肝素后,進入 ICA約18～ 20mm,感覺有阻力時則為阻斷 M CA入口,結扎 ECA近心端,去掉頸總動脈和頸內(nèi)動脈下方的提拉線。10min后從 ECA輕輕抽出尼龍絲線約18～ 20mm,形成第一次再灌注 ,將線尾埋在皮下;縫合皮膚切口,完成腦缺血預處理。72h后將埋在皮下的尼龍絲線再次推入 ICA約 18～ 20mm造成 M CA阻塞(MCAO),90min后將留在皮外的尼龍絲線抽出約18～ 20mm,形成第2次再灌注。各組分別在第2次再灌注后2h,8h,24h,48h,96h評估神經(jīng)功能缺損,并在相應的時間點處死大鼠取出全腦測定腦組織 N GB含量。假手術組僅暴露頸總動脈及分叉處,不插線阻斷M CA。

1.3 檢測指標

于相應時間點,由不了解分組情況的觀察者根據(jù) David-Petullo的行為學評價標準進行評分。評分完畢后,在相應的時間點將大鼠斷頭處死,取腦組織甲醛固定,將固定后的腦組織制成石蠟塊連續(xù)冠狀切片,分別進行 HE、TTC和免疫組織學染色。將不同方法染色的切片經(jīng)脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。

1.4 圖像分析

每個腦組織標本選取5張切片進行圖像分析,在經(jīng)200倍放大的光學顯微鏡下,取缺血側扣帶回皮層區(qū)域進行拍照,用 Image一 J軟件數(shù)出每張照片中 NGB陽性細胞的數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)均以表示,用 SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物的行為學測試

神經(jīng)肌肉運動功能評分:B組和 C組大鼠腦缺血再灌注后2h存在神經(jīng)肌肉運動功能明顯缺失,再灌注后不同時間點 B組評分高于 C組 (P＜0.05),B組和 C組評分均高于A組 (P＜0.05)。前庭運動功能評分與神經(jīng)肌肉運動功能評分情況有所相似。

2.2 免疫組化結果

在腦缺血再灌注后2h,NB在皮質(zhì)區(qū)即有大量表達,24h達到高峰后數(shù)量逐漸下降,再灌注后2h,8h,24h,48hB組和C組 NB表達數(shù)量均高于 A組 (P＜0.05)。B組和 C組在再灌注后各時間點 Ngb表達數(shù)量比較有統(tǒng)計學意義(P ＜ 0.05)。

表1 各組不同時間點 NGB的表達結果 ±s,n=30)

表1 各組不同時間點 NGB的表達結果 ±s,n=30)

2.3 腦組織病理改變

B組在缺血再灌注后2h缺血側額頂部皮質(zhì)和基底節(jié)區(qū)神經(jīng)組織細胞排列開始出現(xiàn)紊亂、腫脹,各時間點腦組織均見神經(jīng)元結構模糊,24h后出現(xiàn)不同程度的核深染,核固縮,核溶解,間質(zhì)水腫 ,血管周圍間隙增寬,組織壞死嚴重。C組神經(jīng)組織細胞的核固縮、核溶解程度比缺血再灌注組明顯減輕,間質(zhì)水腫和血管周圍間隙增寬情況較減少。

2.4 腦梗死體積測定

在再灌注后相同時間點,C組較 B組梗死體積明顯減小,差異具有統(tǒng)計學意義 (P ＜0.05)。

3 討論

近年的研究表明,預先短暫缺血或輕度低氧可激發(fā)或動員機體內(nèi)在防護能力,對隨后的嚴重缺血或缺氧產(chǎn)生強大防御和保護作用。本實驗觀察到,在再灌注后相同時間點,C組較 B組梗死體積明顯減小,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。腦缺血預處理能減少神經(jīng)功能缺損評分和縮小缺血后腦組織梗死體積比,病理形態(tài)學 HE染色檢測也顯示腦缺血預處理對腦再次嚴重缺血損傷有明顯的保護作用。Burmester[5]于 2000年報道了人和小鼠的腦紅蛋白,為氧這一基本生命元素與神經(jīng)系統(tǒng)功能活動之間的關系提供了重要線索。2002年鄧美玉等[6]發(fā)現(xiàn)大鼠大腦皮質(zhì)中 N GBmRN A陽性神經(jīng)元分布廣泛,NGBmRN A產(chǎn)物定位于神經(jīng)元的胞質(zhì)。2004年 Laufs等[7]發(fā)現(xiàn) ,NGB在神經(jīng)元內(nèi)特異性表達 ,而神經(jīng)膠質(zhì)細胞卻不表達。本實驗研究了大鼠腦缺血再灌注后2～96h后在各組大鼠皮層 NGB陽性神經(jīng)元的表達變化情況。觀察發(fā)現(xiàn),在腦缺血再灌注后2h,NB在皮質(zhì)區(qū)即有大量表達,24h達到高峰后數(shù)量逐漸下降。綜上所述腦缺血預處理有助于腦紅蛋白的表達,腦紅蛋白表達升高可能對腦缺血再灌注損傷具有保護作用,可能是局灶性腦缺血耐受產(chǎn)生的分子機制之一。所以腦缺血預處理與 NGB二者結合起來對臨床腦缺氧缺血性疾病治療提供了新的思路,對缺血性腦血管病新藥的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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[3] Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible widdle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91

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[5] Burmester T,Weich B,Reinhardt S,et a1.A vertebrate globin expressed in the brain[J].Nature,2000,407(6803):520

[6] 鄧美玉,張成崗,王航雁,等.免疫組織化學方法檢測腦紅蛋白在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布 [J].中國組織化學與細胞化學雜志,2002,11(3):271-274

[7] Laufs T L,Wystub S,Reuss S,et a1.Neuron-specific expression of neuroglobin in mammals[J].Neurosci Let,2004,362:83-86