人CXCR3基因轉染細胞株的構建、鑒定及初步功能研究①

孫 杰 劉玉華 陳永井 郭靜雅 陳昌友 胡玲玲 陳明心 杜陽陽 徐耀瑜 邱玉華

(蘇州大學醫(yī)學部免疫學系,蘇州 215123)

CXCR3(CD183)-CXC Chemokine Receptor 3是一種七次跨膜的G-蛋白偶聯(lián)受體,基因定位于X染色體q13區(qū),編碼區(qū)長度為1 104 bp,由368個氨基酸組成,分子量為40.659 kD[1,2]。目前已發(fā)現三種可變異構體 CXCR3-A、CXCR3-B、CXCR3-alt,通常所說的CXCR3是指CXCR3-A;有三種配體Mig、IP-10及I-TAC可與之結合[3]。在正常生理狀態(tài)下,CXCR3主要表達于活化/記憶T細胞、NK細胞、巨噬細胞等。在一些疾病病理性進程中如自身免疫性疾病、移植排異、感染等病人外周血淋巴細胞表面呈高表達,在某些惡性腫瘤細胞表面也呈高表達[4-8]。研究表明,CXCR3介導的信號在指導白細胞定向遷移的同時,在腫瘤轉移、自身免疫性疾病和移植排異等疾病的發(fā)生、發(fā)展和預后過程中發(fā)揮重要作用。通過免疫干預手段阻斷CXCR3信號轉導對上述疾病具有積極的治療作用[9]。本研究旨在構建穩(wěn)定表達人CXCR3分子的基因轉染細胞株L929-CXCR3及在配體作用下的遷移效應,為進一步研制CXCR3單克隆抗體及功能研究奠定了物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 LipofectamineTM2000、Zeocin和Top10大腸桿菌購自Invitrogen公司;各種限制性內切酶、T4 DNA連接酶、克隆載體pMD19-T及逆轉錄試劑盒購自Takara公司;瓊脂糖粉購自上海華美公司;小量質粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自上海華舜公司;胎牛血清(FCS)購自Hyclone公司;TRIzol和RPMI1640培養(yǎng)基購自GIBCO公司;PE標記的鼠抗人CXCR3 mAb購自BD公司;24孔Transwell板購自Millipore公司。Mig、IP-10及 I-TAC購自 Peprotech公司;293T、L929細胞購自ATCC,由本室保存;逆轉錄病毒載體pEGZ-term及兩個輔助病毒載體pHIT456和pHIT60由德國Sefling教授惠贈。

1.2 方法

1.2.1 人CXCR3基因的克隆與鑒定 根據GeneBank收錄的人CXCR3基因序列(NM-001504)設計PCR引物,由南京金斯特生物技術有限公司合成。PCR引物為 P1:5′-ATGGTCCTTGAGGTGAGTGACCACC-3′,P2:5′-CTCTGAGGTCTCAGACCAGGATGA-3′。取正常志愿者抗凝外周血100 ml,經Ficoll密度梯度離心分離獲得PBMC,用 50 μ g/ml PHA 的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)3天,再加入400 U/ml的 IL-3誘導3天,收集細胞;TRIzol一步法抽提總RNA,將mRNA逆轉錄成cDNA(按TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書操作),取5 μ l cDNA作為模板,進行PCR擴增。PCR反應條件為:94℃預變性40秒,94℃變性 40秒,60℃退火40秒,72℃延伸80秒,35個循環(huán),72℃延伸10分鐘。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,割膠回收目的片段,用試劑盒純化后與pMD19-T載體連接16℃30分鐘(按試劑盒說明書操作),CaCl2法轉化感受態(tài)大腸桿菌Top10,篩選氨芐青霉素抗性克隆,重組質粒pMD19-T/CXCR3經煮菌PCR、酶切鑒定后,送南京金斯特生物技術有限公司測序驗證。

1.2.2 重組逆轉錄病毒載體的構建 PCR引物為P3:5′-CAGGAATTCACCATGGTCCTTGAGGTGAGTGAC-3′,引入 EcoR Ⅰ 酶切位點 ;P4:5′-ACCGGATCCTCACAAGCCCGAGTAGGAGGCCTCTGAGGTCTCAGACCAG GA-3′,引入 BamHⅠ酶切位點。以測序正確的pMD19-T/CXCR3重組質粒為模板,P3、P4為引物,擴增出含EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點的CXCR3編碼區(qū)基因片段,PCR擴增產物和pEGZ-term載體同時用EcoRⅠ和BamHⅠ進行雙酶切,30℃4小時。回收目的片段,T4 DNA連接酶16℃4小時,連接產物pEGZ-term/CXCR3轉化感受態(tài)大腸桿菌Top10。氨芐青霉素抗性克隆經煮菌PCR、酶切鑒定和測序驗證后,以確定獲得含有正確序列的人CXCR3基因的重組逆轉錄病毒載體pEGZ-term/CXCR3。

1.2.3 穩(wěn)定表達人CXCR3分子的基因轉染細胞株L929-CXCR3的構建 將重組逆轉錄病毒載體pEGZ-term/CXCR3與兩個輔助病毒載體pHIT456和pHIT60按2∶1∶1混合后,用脂質體法共轉染包裝細胞293T(按試劑盒說明書操作)。48小時后收集含完整逆轉錄病毒顆粒的293T培養(yǎng)上清,感染6孔板中60%～70%匯片的L929細胞,同時加入polybrene使其終濃度為8 ng/ml,37℃感染6小時,添加含10%FCS的RPMI1640培養(yǎng)基至2 ml/孔,每隔24小時感染一次,重復感染3次。收集L929細胞,按1∶6稀釋后,將其置于含500 μ g/ml Zeocin的選擇培養(yǎng)基中,篩選培養(yǎng)兩周,挑取單克隆集落,進行擴大培養(yǎng)。同時制備轉染空載體的陰性對照細胞株L929-mock。

1.2.4 FCM分析L929-CXCR3細胞中GFP和膜表面目的分子的表達 收集Zeocin抗性生長的L929-CXCR3細胞,經FCM分析綠色熒光蛋白(GFP)報告基因的表達。同時將PE標記的鼠抗人CXCR3單克隆抗體與L929-CXCR3基因轉染細胞4℃反應30分鐘,用含2%FCS的PBS洗2遍,用FCM檢測人CXCR3分子在細胞膜上的表達。分別以小鼠IgG及L929-mock作為抗體的同型對照及細胞的陰性對照。

1.2.5 RT-PCR檢測L929-CXCR3細胞中人CXCR3基因的轉錄 收集L929-CXCR3細胞,TRIzol抽提其總 RNA,逆轉錄成cDNA,取 5 μ l cDNA 作為模板 ,用前述CXCR3特異性引物P3、P4,擴增人CXCR3目的基因,同時用L929-mock細胞作對照。

1.2.6 L929-CXCR3在其配體作用下遷移能力的分析 在8 μ m的 transwell板上室中加入L929-CXCR3細胞1×105個(400 μ l),下室中分別加入 Mig、IP-10及 I-TAC,濃度梯度依次為,Mig:5、10、20、50、80、100 ng/ml;IP-10:0.5 、2 、5 、10 、20 、50 ng/ml及 I-TAC:1 、2 、5、10、20、50 ng/ml各 600 μ l;用 L929-mock 作為細胞對照,培養(yǎng)基作為趨化因子的陰性對照,每組設三個復孔。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育5小時,用FCM對下室中的細胞計數。(遷移率)%=(下室中的細胞數/上室中接種的細胞總數)×100%。

1.3 統(tǒng)計學分析 利用SPSS17.0統(tǒng)計軟件,采用t檢驗進行統(tǒng)計學分析,結果以±s表示。

2 結果

2.1 人CXCR3編碼區(qū)全長基因的克隆 從活化的人PBMC的mRNA中,用RT-PCR方法擴增出了人CXCR3基因,長約1 100 bp。測序結果與GeneBank中注冊的序列相同(圖1)。

2.2 重組逆轉錄病毒載體的構建 重組逆轉錄病毒經PCR和雙酶切,1%瓊脂糖凝膠電泳分析,目的片段與人CXCR3基因大小基本一致。DNA測序結果表明,所獲得的序列與GeneBank中注冊的序列相同,由此表明已成功構建了人CXCR3基因重組逆轉錄病毒表達載體pEGZ-term/CXCR3(圖2)。

圖1 人CXCR3基因克隆的PCR產物Fig.1 PCR product of human CXCR3 gene identified by agargose gel eletrophoresis

2.3 人CXCR3基因轉染細胞株L929-CXCR3的構建及鑒定 經Zeocin加壓篩選獲得的L929-CXCR3細胞株,FCM分析結果顯示:細胞中GFP的表達率為99.8%(圖3);細胞膜表面CXCR3分子的陽性表達率為98.4%(圖4)。RT-PCR方法進一步從基因水平驗證了L929-CXCR3中人CXCR3基因的表達(圖5)。

2.4 L929-CXCR3在其配體作用下遷移能力的分析Transwell分析結果顯示,Mig、IP-10及I-TAC均可趨化 L929-CXCR3遷移,但起始濃度不同,依次為Mig 10 ng/ml、IP-10 5 ng/ml及 I-TAC 1 ng/ml,相應遷移率分別為2.46%、2.34%及2.24%,并且具有濃度依賴性。三種配體在10 ng/ml時介導L929-CXCR3的遷移率與對照細胞L929-mock的遷移率有顯著性差異(P＜0.01,圖6)。對三種配體在10、20、50 ng/ml時介導L929-CXCR3的遷移率比較發(fā)現,同等濃度條件下,I-TAC引起的遷移率與Mig和IP-10引起的遷移率相比均具有顯著性差異(P＜0.01),而Mig和IP-10相比無顯著性差異(圖7)。

圖2 重組逆轉錄病毒載體的雙酶切鑒定Fig.2 The results of reconstruion pEGZ-term vector digested by EcoRⅠand BamHⅠ

圖3 流式細胞術分析L929-CXCR3細胞中GFP的表達Fig.3 Analysis of GFP report gene expressed in L929-CXCR3 by FCM

圖4 流式細胞術檢測人CXCR3分子在L929-CXCR3上的表達Fig.4 Detection of human CXCR3 molecule expression on the membrane of L929-CXCR3 by FCM

圖5 L929-CXCR3細胞中人CXCR3基因的RT-PCR及凝膠電泳鑒定Fig.5 Identification of human CXCR3 gene in L929-CXCR3 by RT-PCR and gel electrophoresis

圖6 L929-CXCR3在10 ng/ml的Mig、IP-10及 I-TAC作用下的遷移率Fig.6 Chemotatic index of L929-CXCR3 induced by 10 ng/ml Mig,IP-10 and I-TAC

3 討論

圖7 L929-CXCR3在同等濃度的Mig、IP-10及 I-TAC作用下的遷移率的比較Fig.7 Comparisition of chemotatic index of L929-CXCR3 induced by Mig,IP-10 and I-TAC respectively

CXCR3主要表達于活化/記憶T細胞,NK細胞及巨噬細胞等,IL-2可上調CXCR3的表達;有三種CXC趨化因子可與CXCR3結合 ,分別是Mig、IP-10及I-TAC[10]。CXCR3的這三種配體主要表達于內皮細胞、成纖維細胞、角質形成細胞以及單核細胞等,受體-配體相互作用可趨化CXCR3+細胞定向遷移[11]。本研究構建了含有人CXCR3序列的重組逆轉錄病毒載體,將其與兩輔助病毒載體脂質體法共轉染包裝細胞293T,收集含完整逆轉錄病毒顆粒的293T培養(yǎng)上清感染L929細胞,利用500～800 μ g/ml的Zeocin加壓篩選培養(yǎng)2周,挑取單克隆集落,擴大培養(yǎng)。經反復凍存與復蘇后,FCM檢測L929-CXCR3膜表面CXCR3分子的陽性表達率仍在98.0%以上,以確定建立了穩(wěn)定表達人CXCR3分子的基因轉染細胞株L929-CXCR3。

利用 Transwell系統(tǒng)研究了CXCR3三種配體Mig、IP-10及I-TAC對L929-CXCR3的趨化效力。研究結果顯示,L929-CXCR3在Mig、IP-10及I-TAC作用下可發(fā)生遷移,但三種配體的起始濃度不同,并且具有濃度依賴性。另外Mig、IP-10及I-TAC在同等濃度下介導L929-CXCR3的遷移率不同,推測它們與CXCR3可能具有不同的結合位點或不同的親和力,強度依次為I-TAC＞IP-10≥Mig。因此,L929-CXCR3趨化遷移模型的建立對研究自身免疫性疾病與移植排異中淋巴細胞的遷移,以及CXCR3信號轉導在腫瘤轉移過程中的作用,具有相應的實驗價值。

利用本基因轉染細胞株作為免疫原免疫小鼠,可以制備鼠抗人CXCR3單克隆抗體,為進一步研究CXCR3在惡性腫瘤細胞表面的表達及其與腫瘤轉移的相關性奠定了基礎。據文獻報道,CXCR3在黑色素瘤、結腸癌、乳腺癌、B淋巴瘤等腫瘤細胞和組織中高表達,并且與腫瘤轉移密切相關[12-14]。已有研究表明,在黑色素瘤、結腸癌等小鼠腫瘤模型中,應用CXCR3拮抗物AMG487,可有效抑制腫瘤細胞向引流淋巴結的轉移;在乳腺癌模型中,可抑制腫瘤細胞向肺部的轉移;但均不影響原接種部位腫瘤的生長,這為CXCR3單克隆抗體應用于CXCR3+腫瘤的治療提供參考依據[15-17]。我們將以此基因轉染細胞株為基礎,進一步研制鼠抗人CXCR3單克隆抗體,利用單克隆抗體深入研究CXCR3信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉移中的作用。

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