高齲患者變形鏈球菌葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因B-1923位點(diǎn)多態(tài)性

劉學(xué)軍，薛 晶

鄭州大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔內(nèi)科鄭州450052

葡糖基轉(zhuǎn)移酶(glucosyltransferase，GTF)是變形鏈球菌自發(fā)合成的固有酶，可特異地利用蔗糖合成胞外多糖［1-2］，與變形鏈球菌致齲性密切相關(guān)，被認(rèn)為是齲病發(fā)生的重要因素［3］，對(duì)其基因遺傳多態(tài)性的研究對(duì)齲病的防治更具有不可低估的作用。該研究以不同齲敏感人群的變形鏈球菌gtfB-1923這一多態(tài)位點(diǎn)為研究對(duì)象，分析不同基因型致齲菌在不同齲敏感人群中分布的差異，以期發(fā)現(xiàn)其與齲易感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 變形鏈球菌國(guó)際參考株GS5(武漢大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng));153株血清C型變形鏈球菌臨床分離株，94株來(lái)自高齲人群［齲、失及補(bǔ)牙數(shù)(decayed，missing，filled teeth，DMFT)≥6］，59 株來(lái)自無(wú)齲人群(DMFT=0)，均為2006年9月至2008年1月鄭州大學(xué)第四附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科收治病例。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 變形鏈球菌GS5 gtfB基因的全序列參見(jiàn)GenBank，序列號(hào)M17361。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則［4］，采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0自行設(shè)計(jì)引物，上游引物 5’-AGCGACATCTAAGCAAG-3’，下游引物 5’-AAGGAATAAGAAGGGACT-3’，擴(kuò)增1 470 bp的基因片段，由上海捷瑞生物技術(shù)公司合成。

1.3 主要試劑 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、PCR Master Mix及D2000 Marker(北京天根生物科技有限公司)，限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ(美國(guó)Promega公司)，熒光染料GeneFinder(美國(guó)Sigma公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)菌株基因組DNA的提取 取在胰化蛋白胨多價(jià)蛋白胨酵母提取物(TPY)培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)的菌液3 mL，按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取全菌DNA，然后在10 g/L瓊脂糖凝膠中120 V 20 min電泳檢測(cè)，置于GDS8000凝膠自動(dòng)分析儀中觀察，用UV-240紫外分光光度自動(dòng)記錄儀測(cè)定DNA樣品在260和280 nm處的吸光度(A)值，計(jì)算A(260 nm)/A(280 nm)的比值，判斷DNA的純度。

1.5 gtfB片段的PCR擴(kuò)增 以各實(shí)驗(yàn)菌株的全菌基因組DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增目的基因片段?？偡磻?yīng)體積25 μL，組成如下:2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各 0.5 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL。循環(huán)參數(shù):94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性50 s，52 ℃ 退火 50 s，72 ℃ 延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，72℃總延伸10 min。

1.6 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè) 取5 μL PCR產(chǎn)物，加2 μL核酸染料，以D2000 Marker為相對(duì)分子質(zhì)量參照標(biāo)準(zhǔn)，在15 g/L的瓊脂糖凝膠及TBE緩沖液中電泳30 min，電壓為110 V，采用 Gene Genius凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并記錄電泳條帶。

1.7 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragmentlength polymorphism，RFLP)分析 內(nèi)切酶EcoRⅠ的反應(yīng)體系:EcoRⅠ酶0.5 μL，PCR 產(chǎn)物 1 μL，Buffer 2 μL，BSA 緩沖液 0.2 μL，ddH2O 16.3 μL，總反應(yīng)體積20 μL。按照說(shuō)明書(shū)控制酶切條件和時(shí)間，37℃水浴4 h終止酶切反應(yīng)。取5 μL酶切產(chǎn)物加1 μL核酸染料，以D2000 Marker為相對(duì)分子質(zhì)量參照標(biāo)準(zhǔn)，在20 g/L的瓊脂糖凝膠及TBE緩沖液中電泳30 min，電壓為110 V，采用Gene Genius凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并記錄電泳條帶。與標(biāo)準(zhǔn)菌GS5的PCR-RFLP酶譜相同菌株的基因型稱為A型，不同的稱為B型。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0對(duì)不同齲易感人群gtfB的基因型分布情況行χ2檢驗(yàn)，并計(jì)算OR值和95%CI，檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)菌株基因組DNA的提取結(jié)果 所有實(shí)驗(yàn)菌株的DNA抽提產(chǎn)物的A(260 nm)/A(280 nm)的比值均在1.6～2.0之間，表明抽提的DNA無(wú)污染。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果 153株臨床菌株及標(biāo)準(zhǔn)菌株GS5全部可擴(kuò)增出目的基因片段，電泳后在1 470 bp處出現(xiàn)單一強(qiáng)帶，與預(yù)計(jì)相同(圖1)。

圖1 變形鏈球菌臨床

2.3 RFLP分析結(jié)果 GS5經(jīng)EcoRⅠ酶切后可觀察到的2條片段約為1 000和450 bp。臨床菌株經(jīng)EcoRⅠ酶切后則出現(xiàn)2種圖譜:一種與GS5的酶切圖譜一致;另一種只有1個(gè)條帶(1 470 bp)，見(jiàn)圖2。

圖2 變形鏈球菌臨床分離株

2.4 不同齲敏感人群gtfB基因型變形鏈球菌分布情況 結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)，攜帶A型基因的人群高齲患病的風(fēng)險(xiǎn)增加。

表1 不同齲易感人群gtfB基因型變形鏈球菌分布情況

3 討論

變形鏈球菌的致齲性主要在于它能夠牢固地黏附于牙面并代謝食物中的碳水化合物產(chǎn)酸［5］，其GTF通過(guò)合成水不溶性和水溶性葡聚糖而在這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用［6］。變形鏈球菌的GTF有3種不同類型，即GTF-I、GTF-SI和GTF-S。gtfB是與變形鏈球菌致齲性關(guān)系較密切的GTF相關(guān)基因，它所編碼的GTF-I利用蔗糖作為底物合成的水不溶性葡聚糖參與了細(xì)菌之間及細(xì)菌與牙體之間的蔗糖依賴性黏附。有研究［7］發(fā)現(xiàn)齲病的發(fā)生與特定基因型高致齲性變形鏈球菌的定植有關(guān)。高齲個(gè)體通常攜帶有GTFs合成能力高的菌株［8］。作者采用PCRRFLP技術(shù)對(duì)高齲和無(wú)齲者口腔中的變形鏈球菌進(jìn)行檢測(cè)，定性分析gtfB-1923位點(diǎn)不同基因型的檢出率與齲病的關(guān)系，為今后篩選齲高危人群，有針對(duì)性地開(kāi)展預(yù)防工作提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

變形鏈球菌的gtf基因存在廣泛的遺傳多態(tài)性［9-10］。目前發(fā)現(xiàn)gtf有2種情況可形成多態(tài)性:一種是由于gtfB或gtfC的5’端編碼區(qū)基因產(chǎn)生點(diǎn)突變而形成;另一種是由于gtfB與gtfC之間發(fā)生同源重組而導(dǎo)致。關(guān)于點(diǎn)突變與齲易感性關(guān)系的研究，國(guó)內(nèi)少有報(bào)道。作者選擇gtfB-1923位點(diǎn)進(jìn)行研究。gtfB-1923位點(diǎn)位于催化活性區(qū)內(nèi)，催化活性區(qū)是GTFs的主要功能區(qū)，負(fù)責(zé)蔗糖的水解、催化，與其致齲性密切相關(guān)。突變位點(diǎn)明確 A→G致使5’-GAATTC-3’變?yōu)?5’-GAGTTC-3’，避免了實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中因內(nèi)切酶等試劑的選擇不當(dāng)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的酶切位點(diǎn)與突變位點(diǎn)相一致，符合使用內(nèi)切酶技術(shù)進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性研究的條件。作者發(fā)現(xiàn)經(jīng)EcoRⅠ對(duì)特異擴(kuò)增的gtfB片段消化后，獲得2種酶切圖譜，一種與GS5相同，EcoRⅠ位點(diǎn)存在(稱為A型)，在瓊脂糖凝膠上電泳后可觀察到2個(gè)條帶，分別為1 000和450 bp;另一種與GS5不同，只有1個(gè)條帶1 470 bp(稱為B型)。變形鏈球菌國(guó)際參考株GS5(血清C型)是公認(rèn)致齲性較強(qiáng)的毒力株，其GTF合成細(xì)胞外葡聚糖尤其是合成水不溶性葡聚糖的能力較強(qiáng)［11］。統(tǒng)計(jì)分析顯示:2種基因型在齲蝕狀態(tài)不同的人群中檢出率存在差異，在分離出的變形鏈球菌菌株中A型菌株在高齲人群中的比例高于無(wú)齲人群;而B(niǎo)型菌株在無(wú)齲人群中的比例高于高齲人群;高齲組和無(wú)齲組檢出A和B基因型菌株的OR值為3.677，95%CI為1.854～7.293，提示齲的發(fā)生與變形鏈球菌的基因類別有一定的關(guān)系，攜帶A型基因的人群高齲患病的風(fēng)險(xiǎn)增加。結(jié)果提示:gtfB-1923位點(diǎn)A→G的互換可能影響GTF-I酶的活性及功能，這一位點(diǎn)的突變可能與其致齲性相關(guān)。gtfB-1923位點(diǎn)A→G的互換可能下調(diào)酶的活性，從而降低菌株的黏附能力或者合成胞外多糖的能力，進(jìn)而影響菌株的致齲性，臨床上表現(xiàn)為個(gè)體對(duì)齲的低易感性。

［1］岳松齡.現(xiàn)代齲病學(xué)［M］.北京:北京醫(yī)科大學(xué)·中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1993:72

［2］Tamesada M，Kawabata S，F(xiàn)ujiwara T，et al.Synergistic effects of streptococcal glucosyltransferases on adhesive biofilm formation ［J］.J Dent Res，2004，83(11):874

［3］Taubman MA，Nash DA.The scientific and public-health imperative for a vaccine against dental caries ［J］.Nat Rev Immunol，2006，6(7):555

［4］Dieffenbach CW，Lowe TM，Dveksler GS.General concepts for PCR primer design ［J］.PCR Methods Appl，1993，3(3):S30

［5］Idone V，Brendtro S，Gillespie R，et al.Effect of an orphan response regulator on Streptococcus mutans sucrosedependent adherence and cariogenesis［J］.Infect Immun，2003，71(8):4 351

［6］Devulapalle KS，Mooser G.Glucosyltransferase inactivation reduces dental caries［J］.J Dent Res，2001，80(2):466

［7］Mattos-Graner RO，Smith DJ，King WF，et al.Water-insoluble glucan synthesis by mutans streptococcal strains correlates with caries incidence in 12-to 30-month-old children［J］.J Dent Res，2000，79(6):1 371

［8］黃曉晶，劉天佳，楊錦波，等.高齲及無(wú)齲者變形鏈球菌臨床分離株致齲性研究:Ⅱ合成細(xì)胞外多糖能力的實(shí)驗(yàn)研究［J］.華西口腔醫(yī)學(xué)雜志，2000，18(6):419

［9］Yamashita Y，Bowen WH，Kuramitsu HK.Molecular analysis of a Streptococcus mutans strain exhibiting polymorphism in the tandem gtfB and gtfC genes［J］.Infect Immun，1992，60(4):1 618

［10］Chia JS，Lin SW，Hsu TY，et al.Analysis of a DNA polymorphic region in the gtfB and gtfC genes of Streptococcus mutans［J］.Infect Immun，1993，61(4):1 563

［11］Kuramitsu HK.Characterization of extracellular glucosyltransferase activity of Steptococcus mutans［J］.Infect Immun，1975，12(4):738