孕婦血漿中游離胎兒DNA短串聯(lián)重復序列檢測*

陳曉蕾，李新偉，李 楊，陳 輝，雷冬梅，李曉文#

1)鄭州大學基礎醫(yī)學院細胞生物學與醫(yī)學遺傳學教研室鄭州450001 2)第二軍醫(yī)大學病原生物學教研室上海200433 3)漯河高等醫(yī)學專科學校生物學教研室漯河462000 4)鄭州大學第三附屬醫(yī)院病理科鄭州450052

在分子生物學產(chǎn)前診斷中，羊水穿刺術等傳統(tǒng)的采樣方法有可能對孕婦和胎兒造成傷害，而利用孕早中期母體外周血漿中的游離胎兒DNA進行產(chǎn)前診斷，取材簡便安全，容易被孕婦及家屬接受［1-2］，且母血中游離胎兒DNA半衰期很短，前次妊娠不會影響到下次妊娠的診斷結果。孕早中期母體血漿中胎兒DNA含量極其微小，作者應用短串聯(lián)重復序列(short tandem repeat，STR)位點檢測孕早中期胎兒遺傳信息，為建立一種無創(chuàng)性產(chǎn)前診斷的方法奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 標本來源 34例健康孕婦來自鄭州大學第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科門診，年齡25～42歲，無異常妊娠史。經(jīng)B超檢查所孕均為單胎，孕齡7～32周。在知情同意的前提下取材:34例孕婦外周靜脈血作為標本;口腔上皮細胞拭子作為母源對照;孕婦配偶外周血DNA作為父源對照。

1.2 引物合成 參照GenBank的基因序列設計引物，使擴增產(chǎn)物大小在 200～350 bp之間。D17S1293上游引物序列 5’-TGGAGGCTAG GAGTTTTCCT-3’，下游引物序列 5’-GGAGGCAGT GAGTTGTGATT-3’;D21S11上游引物序列5’-TAT GTGAGTCAATTCCCCAAGTGA-3’，下游引物序列5’-GTTGTATTAGTCAATGTTCTCCAG-3’;DXS8377上游引物序列 5’-CACTTCATGGCTTACCAG-3’，下游引物序列 5’-GACCTTTGGAAAGCTAGTGT-3’。引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。使用前分別溶于 TE Buffer，使其終濃度為10 μmol/L，－20℃冰箱保存。

1.3 STR位點檢測方法 ①DNA抽提:孕婦外周血二步離心法離心后取上清得到孕婦外周血血漿［3］，使用Tiangen的血液基因組小量抽提試劑盒，按說明書抽提其DNA。使用Chelex-100法抽提孕婦口腔上皮拭子標本DNA。使用酚氯仿法抽提外周血血細胞基因組DNA。②PCR反應體系:Premix Taq?25 μL;引物(上下游引物等體積混合，終濃度10 μmol/L)4 μL，擴增模板分別為血細胞基因組DNA 1 μL、血漿 DNA 5 μL 及口腔上皮拭子 DNA 2 μL，用超純?nèi)ルx子水補足體系至50 μL。③擴增條件:98℃預變性6 min;94℃ 1 min，63℃ 1 min，70℃ 1 min 30 s，進行2個循環(huán);此后每2個循環(huán)退火溫度依次降低1℃，共進行14個循環(huán);90℃ 1 min，56℃ 1 min，70℃ 1 min 30 s，進行21個循環(huán);60℃延伸25 min。4℃保存。④二次PCR:孕婦血漿DNA 的初次擴增產(chǎn)物分別稀釋 1、5、10、50、100、500及1 000倍;孕婦口腔上皮拭子標本DNA的初次擴增產(chǎn)物稀釋100倍，擴增體系和條件同上。擴增產(chǎn)物經(jīng)80 g/L變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色。

2 結果

34例孕婦血漿樣本在3個STR位點中，每例均有1個以上位點檢出非母源的STR等位基因，即胎兒DNA。在17例父源性DNA存在時，可驗證該條帶為父源性STR等位基因(圖1，以D21S11位點為例)。

圖1 某家系D21S11位點擴增產(chǎn)物電泳圖譜

3 討論

檢測孕婦血漿中游離胎兒DNA雖然取材簡便，安全性強，但其應用上也面臨著很多問題:例如母體白細胞及白細胞來源DNA的污染;胎兒DNA的不穩(wěn)定性及其含量的稀少性和多變性;抽提/定量過程困難、耗時;DNA質(zhì)量太低;PCR抑制因子的存在等。因此，許多技術細節(jié)都影響著最后檢測結果的敏感性和準確性。

取材時間的選擇:孕婦血漿中游離胎兒DNA的含量極少，每mL含量甚至可以低至ng級別，造成嚴重的抽提困難。但其會隨著孕齡的增加而增加，尤其在孕后8周增加迅速，分娩前8周還會出現(xiàn)一次急劇升高。因此，在運用孕婦血漿中的游離胎兒DNA進行產(chǎn)前診斷時，采血時間十分重要。一方面要保證游離胎兒DNA含量達到穩(wěn)定檢測的需求，另一方面要符合中期引產(chǎn)的時間要求，一旦發(fā)現(xiàn)異常胎兒，孕婦決定中止妊娠，不至于對孕婦的身體造成過大的傷害。該組孕婦孕齡7周1例，14～20周32例，32周1例。孕32周的孕婦血漿中胎兒DNA含量較高，初次PCR的產(chǎn)物稀釋1 000倍后作為第二次PCR的模板也能擴增出符合檢測標準的產(chǎn)物;孕14～20周的孕婦血漿中胎兒DNA初次PCR產(chǎn)物稀釋50～500倍作為第二次PCR的模板，均能擴增出符合檢測標準的產(chǎn)物;而孕7周的孕婦血漿中胎兒DNA初次PCR產(chǎn)物不經(jīng)稀釋，直接作為第二次PCR的模板才能擴增出達到檢測標準的產(chǎn)物，表明孕8周以前孕婦血漿中胎兒DNA含量低，與文獻［4］報道一致。本著準確和安全的原則，作者認為，利用孕婦血漿中游離胎兒DNA進行產(chǎn)前診斷時，孕10～15周之間取樣檢測比較合適。

DNA抽提條件:采集孕婦外周血后，必須盡快對血漿和血細胞進行分離。作者在采血6 h內(nèi)對血樣進行處理并抽提DNA［5］。如不能立即進行DNA抽提，采血時不能用肝素或者檸檬酸鈉作為抗凝劑，必須使用EDTA，這樣才能既保護游離DNA不被核酸酶降解，又不干擾后續(xù)的PCR反應［4］。而且應立即置于超低溫(－70℃)條件保存，否則，由于游離胎兒DNA的不穩(wěn)定性和母體血細胞大量裂解釋放背景DNA，24 h后將無法有效抽提到胎兒DNA［6］。

實驗組中母源性干擾的排除:抽提母血中胎兒DNA的另一大難點在于如何在母體DNA背景非常豐富的情況下盡可能地分離胎兒DNA。選擇特定的血漿離心速度非常重要，作者采用二步離心法:先低速離心(800 g)分離血漿與細胞性成分，去除母體血細胞DNA背景;再依據(jù)孕婦體內(nèi)胎源性DNA的長度小于母源性循環(huán)DNA的長度，使用超高速離心(16 000 g)將其區(qū)分開來，可減弱PCR產(chǎn)物電泳圖譜上來自母體DNA的干擾。

提高檢測的敏感性:孕婦血漿DNA、口腔上皮拭子DNA含量偏低，普通的一次PCR無法得到適合判讀的條帶。因此采用二次PCR的方法，以保證檢測的敏感性。但普通的二次擴增很容易出現(xiàn)許多非特異條帶，影響判讀，因此作者將2次擴增都采用降落PCR的方法，雜帶出現(xiàn)明顯減少，保證了擴增的特異性。

選用多個STR位點:當母親與胎兒基因型不同時，會導致額外條帶的出現(xiàn)，此時即使缺乏父源DNA驗證，也能夠很容易地判別非母源條帶，即胎兒DNA。但也存在這樣的可能性，即父母在某一位點至少有一條帶相同，從而可能導致孕婦血漿DNA圖譜中不出現(xiàn)非母源條帶，造成判讀困難。因此需要選用多個高度多態(tài)性的STR位點作聯(lián)合檢測，以保證胎兒DNA的檢出。

總之，以孕婦口腔拭子DNA作為母源性DNA對照，選用多個特異性的STR位點進行聯(lián)合分析，可用于在某些無法得到父本DNA的情況下進行的產(chǎn)前診斷。

［1］易萍，李力，夏季，等.母體血漿中胎兒DNA分析在性連鎖遺傳病產(chǎn)前診斷中的應用［J］.第三軍醫(yī)大學學報，2007，29(6):538

［2］史惠蓉，王慧玲，孔祥東，等.應用巢式 PCR擴增孕婦血漿中胎兒 SRY基因［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2008，43(1):39

［3］雷冬梅，陳曉蕾，李曉文.孕婦血漿中游離胎兒DNA的SRY、DXS8377 檢測［J］.中國婦幼保健，2008，23(25):3 585

［4］Bischoff FZ，Lewis DE，Simpson JL.Cell-free fetal DNA in maternal blood:kinetics，source and structure［J］.Human Reprod Update，2005，11(1):59

［5］李勤，張毅，丁宇烽，等.孕婦血樣采集后體外存放對血漿中胎兒游離DNA水平的影響［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2008，29(9):1 042

［6］González-González C， Garcia-HoyosM， Trujillo-Tiebas MJ，et al.Application of fetal DNA detection in maternal plasma:a prenatal diagnosis unit experience［J］.J Histochem Cytochem，2005，53(3):307