稽留流產(chǎn)絨毛組織中Fas相關死亡結構域蛋白和Livin的表達

楊玲竹，馬麗紅

鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科鄭州450052

稽留流產(chǎn)是自然流產(chǎn)的一種特殊情況，發(fā)病機制不明。有學者［1］認為細胞凋亡在胎盤絨毛組織結構分化及功能完善等方面起重要作用，細胞凋亡的加速可能導致流產(chǎn)、胎兒生長受限及早產(chǎn)等病理過程的發(fā)生。作者檢測了稽留流產(chǎn)患者絨毛組織結構中Fas相關死亡結構域蛋白(Fas-associated protein with death domain，F(xiàn)ADD)和凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis proteins，IAPs)成員 Livin 的表達，探討兩者與稽留流產(chǎn)的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源及處理 選擇2008年7月至11月在鄭州大學第一和第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科收治的稽留流產(chǎn)患者30例作為研究對象(實驗組)?；袅鳟a(chǎn)診斷標準以人民衛(wèi)生出版社第7版《婦產(chǎn)科學》［2］為主。以同期無合并癥的健康人群行人工流產(chǎn)的早孕婦女30例為對照組。所有研究對象無合并癥，無全身感染性疾病，月經(jīng)周期規(guī)律，流產(chǎn)前無用藥史。2組樣本的基本臨床資料如年齡、孕齡、孕產(chǎn)次差異無統(tǒng)計學意義(表1)，均為早期流產(chǎn)(孕周＜12周)。2組研究對象均在確診后第2天行人工流產(chǎn)術取絨毛組織，用生理鹽水沖洗后，取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm，固定完全后石蠟包埋，另取一部分存于液氮中備用。

表1 2組一般資料的比較

1.2 FADD及Livin蛋白的檢測 應用免疫組化SP法檢測FADD及Livin蛋白的表達。兔抗人抗FADD多克隆抗體和兔抗人抗Livin多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術公司，抗體稀釋比例為1∶100。操作步驟嚴格按試劑盒說明書進行。采用試劑盒內(nèi)陽性對照片為陽性對照，用0.01 mol/L PBS代替一抗作陰性對照。參照對照片，F(xiàn)ADD及Livin陽性信號均表現(xiàn)為棕黃色或黃色顆粒狀物，定位于胞質。抽取5個高倍視野，按陽性細胞百分率計分:陽性細胞百分率≤5%為0分，～25%為1分，～50%為2分，～75%為3分，＞75%為4分;再按照染色強度計分:無著色細胞為0分，淡黃色著色為1分，棕黃色著色為2分。2項評分的乘積≥3為陽性表達。

1.3 FADD及Livin mRNA檢測 Trizol提取液和RT-PCR試劑盒均購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司。Trizol法抽提絨毛組織中總RNA，按試劑盒說明書進行反轉錄得cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。FADD引物序列:上游 5’-GAGAAG GAGAACGCAACA-3’，下游 5’-GACGCTTCGGAGG TAGAT-3’，產(chǎn)物大小170 bp。Livin引物序列:上游5’-GACGCTTCGGAGGTAGAT-3’，下游 5’-GCACG GCACAAAGACGAT-3’，產(chǎn)物大小 485 bp。β-actin引物序列:上游5’-ATTGGCAATGAGCGGTTCCGC-3’，下游 5’-CTCCTGCTTGCTGATGCACATC-3’，產(chǎn)物大小336 bp，引物由上海生工生物技術有限公司合成。PCR條件:94℃預變性1 min;94℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環(huán)30次;最后72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖(西班牙全式金公司)凝膠電泳，MGIAS-1000凝膠成像系統(tǒng)掃描定量并拍照。以目的基因條帶與β-actin條帶灰度值的比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0進行統(tǒng)計分析，對2組FADD及Livin蛋白陽性表達率進行χ2檢驗，對兩者mRNA相對表達量的比較采用成組資料設計的t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組胎盤滋養(yǎng)細胞中FADD及Livin蛋白檢測結果 見圖1、表2。

圖1 正常早孕及稽留流產(chǎn)組織中FADD及Livin蛋白的表達(SP，×400)

表2 2組胎盤滋養(yǎng)細胞中FADD及Livin蛋白的表達 例(%)

2.2 2組胎盤滋養(yǎng)細胞中FADD及Livin mRNA檢測結果 見圖2、表3。

圖2 FADD及Livin的RT-PCR擴增結果

表3 2組胎盤滋養(yǎng)細胞中FADD及Livin mRNA的相對表達量

3 討論

FADD是新近克隆出的一種能與Fas相互作用而誘導細胞凋亡的蛋白，其基因位于人11號染色體長臂上，由死亡效應結構域(DED)和死亡結構域(DD)兩部分組成。FADD基因參與多種死亡受體誘導的細胞凋亡信號傳導通路，其主要作用途徑為:Fas與FasL結合導致Fas胞內(nèi)的死亡結構域形成三聚體而活化，并引起與之結合的FADD構象改變，使Caspase-8前體集聚、斷裂和激活，產(chǎn)生有活性的Caspase-8，從而激發(fā)一系列下游的Caspase-3等級聯(lián)反應，誘發(fā)細胞凋亡［3］。FADD異常導致的凋亡通路異常與多種疾病發(fā)病之間聯(lián)系密切［4-5］。作者的實驗結果顯示正常早孕絨毛中有FADD的陽性表達，提示FADD與胚胎發(fā)育密切相關。正常妊娠均存在一定程度的滋養(yǎng)層細胞凋亡，且主要發(fā)生在合體滋養(yǎng)層細胞，說明FADD在胚胎發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要作用［6］。

Livin是IAPs家族的新成員，主要在一些腫瘤組織中高表達，正常組織中表達較少［7］;其BIR功能區(qū)可與Caspase結合，抑制Caspase的活性，尤其是Caspase-3、-7和Caspase-9，通過阻斷凋亡受體和以線粒體為基礎的凋亡途徑而起作用;抑制腫瘤細胞中Livin基因的表達，可增加細胞的凋亡［8］。Ka等［9］用RT-PCR技術檢測到胎盤滋養(yǎng)層細胞JEG-3和絨毛膜瘤細胞系Jar中都有Livin mRNA的表達;通過免疫印跡分析高純化的足月胎盤的滋養(yǎng)層細胞，發(fā)現(xiàn)Livin在絨毛膜滋養(yǎng)層和間充質細胞的細胞核中都有表達，而在合體滋養(yǎng)層細胞中表達較低。表明細胞凋亡特別是滋養(yǎng)層細胞凋亡參與了正常早期妊娠胎盤的生長發(fā)育，在胚胎發(fā)育中也發(fā)揮著重要作用。

作者觀察到實驗組滋養(yǎng)層細胞FADD蛋白及mRNA的表達較對照組明顯增加，而Livin蛋白及mRNA的表達較對照組明顯降低。表明FADD的高表達與Livin的低表達與稽留流產(chǎn)有關。作者還發(fā)現(xiàn)對照組及實驗組中FADD的表達以合體滋養(yǎng)層細胞為主，而對照組和實驗組中Livin的表達以滋養(yǎng)層細胞為主。

作為胎盤功能的主要承擔者，絨毛滋養(yǎng)層細胞中的合體滋養(yǎng)細胞是執(zhí)行功能的分化終末細胞，凋亡的發(fā)生是其必然結局。而細胞滋養(yǎng)層細胞的凋亡則可能與絨毛發(fā)育和DNA修復障礙等有關，當細胞滋養(yǎng)層細胞凋亡增加，打破了維持絨毛正常發(fā)育的平衡狀態(tài)，勢必影響其正常功能的發(fā)揮，使絨毛生長受阻，從而阻礙孕卵的發(fā)育，繼而發(fā)生稽留流產(chǎn)。而Fas凋亡途徑可能是滋養(yǎng)層細胞凋亡的主要途徑。

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