5-氟尿嘧啶固體脂質(zhì)納米粒對S180腹水瘤小鼠的抑瘤作用*

梁春麗，沈國鵬#，王舒雨，杜 斌

1)鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院制藥工程系鄭州450001 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州450001

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)是常用的化療藥物，由于其半衰期短，不良反應(yīng)較多，腹腔內(nèi)局部給藥后不能在腹腔內(nèi)保持長時間的有效濃度，從而影響腹腔內(nèi)的化療效果。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles，SLN)是20世紀(jì)90年代初發(fā)展起來的新一代亞微粒給藥系統(tǒng)，以毒性低、生物相容性好、生物可降解的固態(tài)天然或合成的類脂為載體，將藥物吸附或包裹于脂質(zhì)膜內(nèi)，具有可以控制藥物釋放、避免藥物的降解或泄漏以及良好的靶向性等優(yōu)點［1］。作者以S180腹水瘤小鼠為模型，觀察5-氟尿嘧啶固體脂質(zhì)納米粒(5-FU-SLN)對腹水瘤模型小鼠腹腔內(nèi)化療的效果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 JJ500型精密電子天平(美國雙杰兄弟有限公司)，電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(北京北瑞科信儀器有限公司)，手術(shù)器械(張家港市雙鹿醫(yī)療器械有限公司)，TGL-16G離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，XSP3A單目顯微鏡(上海萬衡精密光學(xué)儀器廠)。5-FU(常州劍湖化工有限公司，批號:061108，純度≥99%)，空白SLN和5-FU-SLN(鄭州大學(xué)納米藥物研究中心制備)，生理鹽水(河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號:090522242)。

1.2 動物與瘤株 健康昆明種小鼠(鼠齡4～5周，雌性，體質(zhì)量18.0～22.0 g)購自河南省實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(豫)2005-0001;小鼠S180肉瘤腹水型瘤株為中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物與流行病研究所藥學(xué)研究室饋贈。

1.3 5-FU-SLN的制備 精密稱取處方量單硬脂酸甘油酯和氫化大豆卵磷脂，加入無水乙醇和氯仿混合溶液(1∶1)，55℃水浴溶解，得到脂質(zhì)溶液。稱取處方量5-FU，置超純水中超聲水浴溶解制成內(nèi)水相，同時稱取表面活性劑泊洛沙姆-188適量，溶于PBS溶液中作外水相;控制一定的滴速、轉(zhuǎn)速，將內(nèi)水相滴入脂質(zhì)溶液中，形成W/O型混懸液，滴加完畢后超聲分散;再將其滴入含表面活性劑的同溫度外水相中，攪拌乳化，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，緩慢除去有機(jī)溶劑，200 W超聲分散1 min，形成W/O/W型5-FU-SLN 混懸液［2-4］。

1.4 小鼠腹水瘤模型的建立 取凍存復(fù)蘇的S180細(xì)胞株在體積分?jǐn)?shù)為5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)，傳至2代，用無菌生理鹽水調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)至1×107mL－1，無菌條件下每只小鼠腹腔注射0.2 mL。接種第7天，無菌條件下抽取S180荷瘤小鼠淡黃色癌性腹水，加無菌生理鹽水調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×107mL－1的瘤細(xì)胞懸液，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為0.2%的臺盼藍(lán)染色，細(xì)胞存活率＞95%。

1.5 動物分組與給藥方法 模型小鼠稱質(zhì)量后隨機(jī)分為生理鹽水對照組、空白SLN組(Blank-SLN組)、5-FU溶液組(5-FU葡萄糖溶液)及5-FU-SLN組，每組20只。5-FU溶液組和5-FU-SLN組給藥劑量為20 mg/(kg·d)，生理鹽水對照組、空白SLN組為等容量生理鹽水和空白SLN懸液。均腹腔注射給藥，1次/d，連續(xù)7 d。

1.6 檢測指標(biāo) 每天觀察各組小鼠的一般情況，隔天測量體質(zhì)量和腹圍。末次給藥后次日(第8天)，在無菌條件下頸椎脫臼處死各組半數(shù)小鼠，用注射器收集腹腔中全部腹水后，測量腹水體積，每只取0.4 mL新鮮腹水，臺盼藍(lán)染色后鏡檢計瘤細(xì)胞總數(shù)和瘤細(xì)胞存活率［2］。細(xì)胞存活率 =(未染色細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。處死的小鼠解剖觀察腹腔內(nèi)臟器的病理變化，肝臟組織用體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛固定后，石蠟包埋，HE染色鏡檢。剩余小鼠停止治療，統(tǒng)計平均生存時間，計算生命延長率。生命延長率=(給藥組生存時間/生理鹽水對照組生存時間－1)×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 15.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析和SNK-q檢驗比較處理7 d后各組小鼠體質(zhì)量、腹圍、腹水量、瘤細(xì)胞數(shù)、瘤細(xì)胞存活率及平均生存時間和生命延長率。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

表1 各組小鼠體質(zhì)量及腹圍的變化

表2 各組小鼠腹水量、瘤細(xì)胞數(shù)及瘤細(xì)胞存活率比較

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察 給藥期間，各組動物飼養(yǎng)環(huán)境相同，大部分存活，僅有個別死亡(生理鹽水對照組死亡1只，Blank-SLN組死亡2只，5-FU溶液死亡1只)。開始給藥后2～3 d，生理鹽水對照組荷瘤鼠腹部迅速增大，至第4天時腹部膨隆，進(jìn)食進(jìn)水量明顯減少，且活動減少，對外界刺激反應(yīng)遲鈍，出現(xiàn)活動受限、倦怠乏力等衰竭癥狀，晚期出現(xiàn)明顯的球狀腹，部分小鼠大便異常(便稀，膿血便)，尿液中出現(xiàn)淡黃色黏稠液。Blank-SLN組表現(xiàn)與生理鹽水對照組相近，而5-FU溶液組和5-FU-SLN組小鼠腹部增大出現(xiàn)均較生理鹽水對照組晚，且進(jìn)展較慢，與正常小鼠相比差異不明顯。

2.2 各組小鼠體質(zhì)量和腹圍的變化 見表1。

2.3 各組小鼠腹水量、瘤細(xì)胞數(shù)及瘤細(xì)胞存活率比較 生理鹽水對照組和Blank-SLN組的小鼠有大量血性腹水，氣味刺鼻;5-FU溶液組解剖后血性腹水量也較多;5-FU-SLN組有少量淡黃色腹水。各組小鼠腹水量、瘤細(xì)胞數(shù)及瘤細(xì)胞存活率見表2。

2.4 各組小鼠肝臟病理學(xué)檢查 生理鹽水對照組、Blank-SLN組及5-FU溶液組小鼠處死后解剖均發(fā)現(xiàn)肝臟表面光澤差，灰黃，邊緣鈍，各葉之間有粘連，質(zhì)脆，有黏性物質(zhì)和不同程度的淡黃色針尖樣病灶。而5-FU-SLN組解剖后肝臟肉眼觀察各葉之間未見粘連，質(zhì)地較堅韌，切面未見明顯充血、淤血和針尖樣病灶。肝臟病理切片見圖1。結(jié)果顯示:生理鹽水對照組、Blank-SLN組和5-FU溶液組肝臟組織可見較多核深染的癌細(xì)胞，排列緊密，有異型性(多邊形、馬蹄形及扁平型);胞核大，胞質(zhì)較少，核質(zhì)比明顯異常，可見巢狀結(jié)構(gòu);多數(shù)肝細(xì)胞壞死，細(xì)胞出現(xiàn)空泡型變性，核固縮現(xiàn)象多。而5-FU-SLN組腫瘤細(xì)胞浸潤程度較輕，形態(tài)正常無塌陷，異型細(xì)胞少，肝臟細(xì)胞較為正常。

圖1 各組小鼠肝臟病理形態(tài)學(xué)變化(HE，×200)

2.5 各組小鼠生存時間與生命延長率 見表3。

表3 各組小鼠生存時間及生命延長率比較

3 討論

腹腔內(nèi)化療是一種選擇性區(qū)域化療方案，該方案能有效增加藥物和腹膜的接觸面積，提高局部藥物濃度，而全身毒副作用較輕。作者發(fā)現(xiàn):5-FU溶液組的體質(zhì)量增長比5-FU-SLN組緩慢，腹圍增長速度卻比5-FU-SLN組快，可能是由于5-FU溶液腹腔內(nèi)給藥后藥物選擇性差，代謝快，對骨髓和胃腸道毒性較大，導(dǎo)致動物食欲減退，形體消瘦［5］。5-FUSLN組的腹水量、瘤細(xì)胞數(shù)都少于5-FU溶液組，且瘤細(xì)胞存活率低于5-FU溶液組，提示5-FU-SLN劑型腹腔給藥對腹水瘤的抑制作用比5-FU溶液顯著。5-FU-SLN在腹腔液內(nèi)緩慢釋放，瘤細(xì)胞長時間浸泡在化療藥物中，提高了瘤細(xì)胞毒作用，抑制腹腔內(nèi)的腫瘤細(xì)胞增殖，有效地控制瘤細(xì)胞擴(kuò)散，同時延長了小鼠的生存時間。5-FU-SLN組與5-FU溶液組相比未見肝臟轉(zhuǎn)移，提示5-FU-SLN腹腔給藥對腫瘤腹腔內(nèi)臟器轉(zhuǎn)移的抑制作用優(yōu)于5-FU溶液。肝臟轉(zhuǎn)移減少的原因可能是固體脂質(zhì)納米粒容易在肝、脾等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)聚集，藥物在肝、脾中的濃度高，從而抑制了肝臟轉(zhuǎn)移［6-7］。

總之，作者的實驗結(jié)果證實5-FU-SLN腹腔化療在保持腹腔化療優(yōu)勢的同時，對腹水的抑制作用增強(qiáng)，有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，延長了動物的存活時間，且小鼠腫瘤細(xì)胞浸潤程度減輕，肝臟細(xì)胞趨于正常。對于5-FU-SLN小鼠腹腔化療的藥代動力學(xué)與靶向性，有待下一步深入研究。

［1］陸彬.藥物新劑型與新技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:329

［2］徐淑云，卞如濂，陳修.藥理實驗方法學(xué)［M］.3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1 757

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