兩種羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法的比較*

雷寧?kù)o，胡 煒，王成春，朱根明，楊琳琳，關(guān)方霞#

1)鄭州大學(xué)生物工程系鄭州450001 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科鄭州450052

生物活性材料可用于修補(bǔ)受損組織和大面積缺損，是組織工程的研究熱點(diǎn)。羊膜具有免疫原性極低，排異反應(yīng)小，可分泌多種生長(zhǎng)因子并含有多種炎性因子及新生血管抑制因子等生物學(xué)特性，是一種良好的生物活性載體［1］。羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)是一種特殊的細(xì)胞外基質(zhì)，作為細(xì)胞培養(yǎng)的生物載體，特別是作為生物活性載體，已用于干細(xì)胞體外培養(yǎng)。又因其免疫原性低而廣泛用于眼科、臨床燒傷外科及骨科等皮膚、黏膜及神經(jīng)重建移植研究［2］。作者采用2種改進(jìn)方法進(jìn)行羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備，比較其脫細(xì)胞效果，并用于臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，觀察臍帶間質(zhì)干細(xì)胞與羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的生物相容性，為進(jìn)一步進(jìn)行組織工程研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 基礎(chǔ)培養(yǎng)基［體積比1∶1的DMEM/F12培養(yǎng)液，體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清，20 μg/L堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)］，青、鏈霉素，胰蛋白酶，EDTA，TritonX-100，倒置顯微鏡 IX71(日本Olympus公司)，細(xì)胞培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，掃描電鏡。

1.2 羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備 無(wú)菌條件下取正常足月剖宮產(chǎn)胎兒胎盤(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院)，采取前征得產(chǎn)婦知情同意，實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。鈍性分離羊膜約10 cm×10 cm，去除絨毛膜組織，保留羊膜層。

①Triton法:新鮮羊膜經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗干凈后置于體積分?jǐn)?shù)0.1%TritonX-100溶液中，振蕩，置于恒溫培養(yǎng)箱中保存36 h，取出后用生理鹽水漂洗干凈。加入25 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L EDTA，充分振蕩，37℃保存4 h。取出后用生理鹽水漂洗干凈，裁剪成1 cm×1 cm大小后分裝密封。

②甘油法:新鮮羊膜沖洗干凈后置于培養(yǎng)皿中甘油浸泡，4℃保存，24 h×3次;生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，25 g/L胰蛋白酶+0.2 g/L EDTA 4℃作用10 h。取出后用生理鹽水漂洗干凈，裁剪成1 cm×1 cm大小后分裝密封。

1.3 臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的制備及傳代 將上述胎盤所附帶的臍帶剪成約2 cm的段狀，用生理鹽水沖洗干凈。剝?nèi)ツ殠?nèi)兩條動(dòng)脈和一條靜脈，再用生理鹽水充分洗滌，剪碎成泡沫狀，移液管吸取適量的臍帶組織至培養(yǎng)瓶中，加入已配置好的培養(yǎng)基(DMEM/F12培養(yǎng)液，體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清，體積分?jǐn)?shù)0.67%bFGF，體積分?jǐn)?shù)1%的青、鏈霉素)，吹打均勻后置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3～4 d更換培養(yǎng)液一次。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到80% ～90%融合鋪滿瓶底時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.4 羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)性狀觀察

1.4.1 殘余細(xì)胞數(shù) 2種羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)各取6張樣本置于載玻片上，HE染色，100倍鏡下每張選取10個(gè)不同視野，采用網(wǎng)格計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)相同面積內(nèi)的殘余細(xì)胞數(shù)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。鏡下觀察到深藍(lán)染色者計(jì)數(shù)為1個(gè)殘余細(xì)胞。

1.4.2 電鏡觀察 用生理鹽水將羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)清洗干凈，然后用體積分?jǐn)?shù)0.25%戊二醛固定，送檢，掃描電鏡下觀察2種脫細(xì)胞基質(zhì)的形態(tài)。

1.4.3 臍帶間質(zhì)干細(xì)胞在羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)上的生長(zhǎng)狀況 2種羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)用培養(yǎng)液預(yù)濕，展開置于6孔板內(nèi)，將傳至第3代的人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞懸液(2×105mL－1)0.2 mL接種于脫細(xì)胞基質(zhì)，加入 4.8 mL DMEM/F12 培養(yǎng)液，0.03 μL bFGF，置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液，HE染色，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞黏附情況。將第3代人臍帶間質(zhì)干細(xì)胞以4×104mL－1分別接種在底部包被2種基質(zhì)的24孔板中，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，每隔24 h取6孔，胰酶消化混合后重懸細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)活細(xì)胞總數(shù)，重復(fù)3次，取平均值為當(dāng)天的活細(xì)胞計(jì)數(shù)，共計(jì)數(shù)4 d。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 12.0處理數(shù)據(jù)，2種殘余細(xì)胞數(shù)及臍帶間質(zhì)干細(xì)胞活細(xì)胞計(jì)數(shù)的比較用成組資料的t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2種羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)形態(tài)的比較 2組脫細(xì)胞后的羊膜均為白色透明的膜狀物，柔韌性好。HE染色可見，2種脫細(xì)胞基質(zhì)表面無(wú)藍(lán)色核染物質(zhì)(圖1A、B)。掃描電鏡下觀察，2種脫細(xì)胞基質(zhì)亦未見細(xì)胞殘留;Triton組羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)可見縱橫交錯(cuò)的編織狀纖維;甘油組樣本表面凹凸不平，看不到細(xì)胞形態(tài)(圖1C、D)。Triton組殘余細(xì)胞數(shù)為(1.13±0.35)，甘油組為(1.11 ±0.22)，2 組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.920，P=0.888)。

圖1 2種羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)形態(tài)觀察

2.2 臍帶間質(zhì)干細(xì)胞在2種羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)上的生長(zhǎng)狀況 臍帶間質(zhì)干細(xì)胞約6 h即可在2種羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)表面黏附。2組細(xì)胞增殖情況見表1。

表1 2組臍帶間質(zhì)干細(xì)胞活細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果 104mL－1

3 討論

生物載體材料是組織工程研究的基礎(chǔ)，目前，生物載體材料主要有兩大類，一類是人工合成材料，另一類是天然生物材料。與人工合成材料相比，天然生物材料具有無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn):一方面，天然生物材料直接取自生物體內(nèi)，有良好的生物相容性和生物可降解性，且降解產(chǎn)物無(wú)毒副作用;另一方面，天然生物材料本身就具有相同或類似于細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可促進(jìn)細(xì)胞黏附、增殖和分化［3］。因此，天然生物材料已成為人們研究的熱點(diǎn)。

目前臨床上使用的羊膜主要為新鮮羊膜、深冷保存羊膜和脫細(xì)胞羊膜(也稱羊膜脫細(xì)胞基質(zhì))。國(guó)外多采用深低溫(－80℃)保存的含有上皮細(xì)胞的羊膜，因技術(shù)工藝要求復(fù)雜，保存成本過高，不為國(guó)內(nèi)所采用。羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)不含羊膜上皮細(xì)胞，保留了羊膜基底膜與致密層，它的主要成分是Ⅲ、Ⅳ及Ⅴ型膠原蛋白，蛋白多糖和糖蛋白，是一種天然的細(xì)胞外基質(zhì)，可能是良好的組織工程生物載體材料。然而，目前常用的羊膜脫細(xì)胞處理方法是胰酶酶解及物理方法［4］，膜制備過程中可能會(huì)產(chǎn)生二次污染，并且過度酶解會(huì)破壞羊膜基質(zhì)的蛋白結(jié)構(gòu)及韌性，器械處理也可能會(huì)對(duì)羊膜造成損傷。這些不足均降低了羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)作為天然細(xì)胞外基質(zhì)的優(yōu)越性。

作者采用2種方法處理新鮮羊膜，一組使用TritonX-100和酶消化法進(jìn)行處理，該方法操作簡(jiǎn)單，用時(shí)較短(約需2 d);另一組使用甘油浸泡和酶消化法進(jìn)行處理，操作也簡(jiǎn)單，耗時(shí)較長(zhǎng)(約需4 d)。TritonX-100是常用的非離子性表面活性劑，能溶解脂質(zhì)。甘油的重要特點(diǎn)之一是無(wú)毒無(wú)刺激，不會(huì)對(duì)生物組織造成傷害。2種方法得到的羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)均無(wú)細(xì)胞殘留，均對(duì)臍帶間質(zhì)干細(xì)胞有良好的細(xì)胞相容性，但是臍帶間質(zhì)干細(xì)胞在Triton組羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)上的細(xì)胞增殖情況明顯優(yōu)于甘油組。從電鏡掃描結(jié)果可看出，TritonX-100處理的羊膜可見縱橫交錯(cuò)的編織狀纖維，不含壞死組織，基質(zhì)成分完整，三維結(jié)構(gòu)清晰;而甘油處理的樣本盡管無(wú)細(xì)胞殘留，但無(wú)法觀察到縱橫交錯(cuò)的編織狀纖維，其三維結(jié)構(gòu)塌陷，原因可能為甘油強(qiáng)力脫水后影響三維結(jié)構(gòu)及胰酶處理時(shí)間過長(zhǎng)，影響基質(zhì)的蛋白結(jié)構(gòu)從而影響三維結(jié)構(gòu)。據(jù)文獻(xiàn)［5］可知，細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖不僅與培養(yǎng)基及生長(zhǎng)因子相關(guān)，而且與所貼敷材料的空間物理結(jié)構(gòu)有關(guān)，種植材料表面的理化性質(zhì)能影響生物大分子層的結(jié)構(gòu)、組成和空間構(gòu)象，進(jìn)而導(dǎo)致不同的細(xì)胞學(xué)表現(xiàn)。

綜上所述，作者認(rèn)為，TritonX-100預(yù)處理并酶消化法是制備羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)較好的方法。

［1］蔡瓊霞，熊華鋒，胡葵葵，等.臍血間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)的理論研究與應(yīng)用［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11(28):5 630

［2］宋永周，崔慧先，王振顯，等.羊膜脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及其生物相容性［J］.中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12(1):51

［3］杜心欣，瓦龍美.天然生物材料在皮膚組織工程中的應(yīng)用［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2006，12(9):515

［4］肖光禮，聶衛(wèi)，高萍，等.脫細(xì)胞羊膜制備及生物學(xué)評(píng)價(jià)［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2009，16(1):1

［5］張春寶，陳富林，張蓉，等.Ti-75合金對(duì)人成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和功能分化的影響［J］.實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志，2000，16(1):24