脂質(zhì)體介導(dǎo)的hTERT PEI/ASODN縮合體對乳癌MCF-7細(xì)胞生長及hTERT表達(dá)的影響*

權(quán)松霞，張振中，邵彥江，王曉娟，李惠翔#

1)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室;鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科鄭州450052 2)鄭州大學(xué)藥學(xué)院鄭州450001

端粒酶(telomerase)是一種核蛋白酶，以其自身RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成端粒DNA，在染色體末端增加TTAGGG重復(fù)序列以補(bǔ)償端粒的縮短，在絕大多數(shù)的細(xì)胞永生化和腫瘤的形成過程中起關(guān)鍵性作用［1］，針對端粒酶為靶點(diǎn)的腫瘤治療策略是近年來研究的熱點(diǎn)［2］。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是合成端粒酶的限速亞單位，它的表達(dá)量對端粒酶的活性調(diào)控起著決定性作用［1-4］。利用反義核酸技術(shù)，人工合成hTERT mRNA反義寡核苷酸(ASODN)抑制端粒酶的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，是目前腫瘤基因治療的方向之一。未經(jīng)修飾的寡核苷酸易被核酸酶降解，細(xì)胞攝入率低。聚乙烯亞胺(PEI)可將ASODN縮合成納米大小的顆粒狀物，有利于ASODN進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。但是，PEI具有明顯的細(xì)胞毒性，而 PEI/ASODN縮合體在體內(nèi)應(yīng)用時會被單核吞噬細(xì)胞迅速清除。脂質(zhì)體作為一種載體，可將藥物粉末或溶液包埋在直徑為納米級的微粒中，這種微粒具有類細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)入人體后被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而激活機(jī)體的自身免疫功能，并改變被包封藥物的體內(nèi)分布，使藥物主要在肝、脾、肺和骨髓等組織或器官中積蓄，從而提高藥效，減少藥物的治療劑量和降低藥物的毒性［5］。作者以脂質(zhì)體作為 hTERT PEI/ASODN縮合體的載體，觀察其對乳癌MCF-7細(xì)胞生長和hTERT表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 縮合體由課題組自制。RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶購自Gibco公司，優(yōu)級胎牛血清購自天津TBD公司，MTT為Amreseo公司產(chǎn)品，兔抗人hTERT多克隆抗體為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，通用型SP免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，Trizol試劑為Sigma公司產(chǎn)品，其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。梯度PCR擴(kuò)增儀(美國BIO-RAD公司)，TCS-SP2型激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)，高速低溫臺式離心機(jī)(美國Beckman公司)，酶標(biāo)儀(奧地利TECAN公司)。

1.2ASODN和正義寡核苷酸(SODN)的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)hTERT DNA基因序列(AF128893)設(shè)計(jì)ASODN， 序 列 為:5’-CCGCCCTCTCCTCGCG GCGCGAGTT-3’;作用位點(diǎn)是調(diào)節(jié)hTERT基因轉(zhuǎn)錄的Sp1蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。另設(shè)計(jì)SODN序列作對照:5’-GAGCATTAGCACCGCGGGC-3’。經(jīng)計(jì)算機(jī)網(wǎng)上 BLAST檢索，上述 ASODN及 SODN序列與hTERT基因以外的人類基因均無同源性，均由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳癌MCF-7細(xì)胞由河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院王慶端教授提供。用含體積分?jǐn)?shù)10%的滅活胎牛血清，含100 mg/L青霉素、鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每2～3 d用2.5 g/L胰酶消化，換液傳代。

1.4 縮合體攝取情況的觀察 采用6孔板制備細(xì)胞爬片，轉(zhuǎn)染前用無血清RPMI 1640沖洗3遍，每孔加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)液800 μL，其中2孔加100 mg/L ASODN-熒光素各 200 μL，2 孔加 100 mg/L PEI/ASODN-熒光素各 200 μL，2 孔加 100 mg/L脂質(zhì)體-PEI/ASODN-熒光素各200 μL，培養(yǎng)2 h后，棄轉(zhuǎn)染液，PBS沖洗3遍，用體積分?jǐn)?shù)75%的冰乙醇固定30 min，取出細(xì)胞爬片，置于載玻片上，采用激光共聚焦掃描顯微鏡于透射模式觀察細(xì)胞輪廓及形態(tài)，激光激發(fā)模式(激發(fā)波長488 nm)下觀察縮合體攝入情況。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前1 d，96孔板按8×103/孔、6 孔板按2 ×105/孔接種細(xì)胞，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。轉(zhuǎn)染前用無血清RPMI 1640洗板2次。實(shí)驗(yàn)分9組:空白對照組、ASODN 組(20 mg/L)、SODN 組(20 mg/L)、溶媒組、空白脂質(zhì)體組、PEI/ASODN組(20 mg/L)、PEI/SODN組(20 mg/L)、脂質(zhì)體-PEI/ASODN組(20 mg/L)和脂質(zhì)體-PEI/SODN組(20 mg/L)。各組試藥用無血清培養(yǎng)液按比例稀釋后小心滴入細(xì)胞并充分混勻，培養(yǎng)4 h后，棄轉(zhuǎn)染液，PBS沖洗3遍后更換正常含血清及RPMI 1640培養(yǎng)基，并進(jìn)行以下觀察。

1.6 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 在細(xì)胞培養(yǎng)狀態(tài)下，用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h生長狀態(tài)及形態(tài)學(xué)變化。

1.7 細(xì)胞的生長情況 取出分別培養(yǎng)24、48和72 h的各組細(xì)胞，每孔加入終濃度為5 g/L的MTT溶液 20 μL，4 h 后加入二甲基亞砜 150 μL，振蕩 10 min，用酶標(biāo)儀測492 nm處的光密度值。

1.8 hTERT蛋白的檢測 采用免疫細(xì)胞化學(xué)法。制備各組轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞爬片，使用免疫細(xì)胞化學(xué)SP法檢測hTERT蛋白的表達(dá)。一抗為兔抗人hTERT多克隆抗體(工作濃度1∶100)，按試劑說明書操作，DAB顯色，蘇木素復(fù)染。以PBS代替一抗作為陰性對照。光鏡下觀察，陽性結(jié)果為胞核或胞質(zhì)著棕黃色。

1.9 hTERT mRNA水平測定 采用RT-PCR法。hTERT基因PCR擴(kuò)增引物參照文獻(xiàn)［3］，并經(jīng)Gen-Bank檢索證實(shí)。hTERT上游引物:5’-CGGAAGA GTGTCTCCAGCAA-3’，下 游 引 物:5’-GGAT GAAGCGGAGTCTGGA-3’，擴(kuò)增片段長度為145 bp。內(nèi)參 β-actin上游引物:5’-CAAGGCCAACCGC GAGAAGATG-3’，下 游 引 物:5’-GTCCAGGGCG ACGTAGCACAGC-3’，擴(kuò)增片段長度330 bp。上述引物均由上海博興公司合成。各組細(xì)胞于轉(zhuǎn)染48 h后應(yīng)用Trizol試劑盒提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，用于PCR。擴(kuò)增條件:50℃逆轉(zhuǎn)錄30 min，94℃逆轉(zhuǎn)錄酶失活2 min;94℃變性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸90 s，35個循環(huán);72℃延伸6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)樣于20 g/L瓊脂糖凝膠，應(yīng)用凝膠成像分析處理系統(tǒng)攝像。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 11.0處理數(shù)據(jù)。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48和72 h光密度值的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 體外攝取實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果 單純的ASODN轉(zhuǎn)染時細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度極弱;PEI/ASODN組、脂質(zhì)體-PEI/ASODN復(fù)合物轉(zhuǎn)染細(xì)胞2 h后，可見大量熒光物質(zhì)聚集在細(xì)胞核中。見圖1。

2.2 形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果 空白對照組、ASODN組、SODN組、溶媒組、空白脂質(zhì)體組、脂質(zhì)體-PEI/SODN組均生長狀態(tài)良好;PEI/SODN組、PEI/ASODN組在轉(zhuǎn)染4 h后，可見細(xì)胞表面黏附大量大小相似的顆粒;脂質(zhì)體-PEI/ASODN組轉(zhuǎn)染后隨時間的延長，細(xì)胞體積變小，形態(tài)狹長，間隙增大，連接松散，貼壁細(xì)胞逐漸變圓、漂浮。見圖2。

2.3 細(xì)胞的生長情況 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48和72 h后，MTT法測得的光密度值比較見表1。

表1 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染24、48和72 h的光密度值比較(n=3)

2.4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞hTERT mRNA檢測結(jié)果 見圖3。

圖3 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞hTERT mRNA的表達(dá)

2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞hTERT蛋白檢測結(jié)果 轉(zhuǎn)染48 h時，空白對照組、ASODN組、SODN組、溶媒組、空白脂質(zhì)體組、PEI/SODN組及脂質(zhì)體-PEI/SODN組細(xì)胞為陽性著色;PEI/ASODN及脂質(zhì)體-PEI/ASODN組細(xì)胞為陰性著色。見圖4。

圖4 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞hTERT蛋白的表達(dá)(免疫細(xì)胞化學(xué)SP法，×400)

3 討論

反義核酸技術(shù)是根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，用人工合成或生物體合成的特定的反義核酸來抑制或封閉基因表達(dá)的技術(shù)［4］，但是未經(jīng)修飾的寡核苷酸易被胞內(nèi)核酸酶降解。該研究運(yùn)用PEI將ASODN有效壓縮以后，制備成氮磷比為10的PEI-ASODN納米微?？s合體，再用中性脂質(zhì)體將其有效包裹后，轉(zhuǎn)染人乳癌MCF-7細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)表明:該載體可以有效進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并抑制細(xì)胞的生長，這與多數(shù)學(xué)者的研究結(jié)果相似［6］。PEI/ASODN、PEI/SODN 也顯示出較強(qiáng)的抑制MCF-7細(xì)胞生長的作用，但在轉(zhuǎn)染4 h后，可見細(xì)胞表面黏附大量大小相似的顆粒，與文獻(xiàn)［7］報(bào)道一致，即PEI在細(xì)胞膜上可形成2～6 μm的團(tuán)片狀物，而脂質(zhì)體-PEI/SODN組和脂質(zhì)體-PEI/ASODN組并無此種表現(xiàn)，說明中性脂質(zhì)體通過對PEI/SODN或PEI-ASODN的有效包裹，很好地降低了PEI的細(xì)胞毒性。此外，該研究還顯示，hTERT ASODN作用于MCF-7細(xì)胞48 h后hTERT基因表達(dá)未被完全抑制，表明 hTERT ASODN只能下調(diào)hTERT基因的表達(dá)，并不能完全封閉該基因。這一結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)hTERT的調(diào)控是非常復(fù)雜的，要結(jié)合其他的細(xì)胞調(diào)控途徑綜合評價(jià)。

總之，該研究結(jié)果顯示hTERT基因的ASODN以序列特異性方式抑制基因的表達(dá)，從而抑制端粒酶活性，證實(shí)了中性脂質(zhì)體作為載體的有效性和安全性;可以通過對中性脂質(zhì)體進(jìn)行修飾及與特定細(xì)胞表面受體的配體相偶聯(lián)，達(dá)到靶向性基因轉(zhuǎn)染的目的，為腫瘤靶向性的基因治療的體內(nèi)研究提供一種新的方法。

［1］Cong YS，Wright WE，Shay JW.Human telomerase and its regulation［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2002，66(3):407

［2］Greider CW.Telomerase activity cell，proliferation and cancer［J］.Proc Natl Acid Sci USA，1998，95(1):90

［3］Takakura M，Kyo S，Tanaya M，et al.Expression of human telomerase subunits and correlation with telomerase activity in cervical cancer［J］.Cancer Res，1998，58(7):1 558

［4］Tao M，Miyano Kurosaki N，Takai K，et al.Specific inhibition of human telomerase activity by transfection reagent，F(xiàn)uGENE6-antisense phosphorothioate oligonucleotide complex in Hela cells［J］.FEBS Lett，1999，454(3):312

［5］Harada-Shiba M，Yamauchi K，Harada A，et al.Polyion Complex micelles as vectors in gene therapy-pharmacokinetics and in vivo gene transfer［J］.Gene Ther，2002，9(6):407

［6］Herbert BS，Pongracz K，Shay JW，et al.Oligonucleotide N3’→P5’phosphoramidates as efficient telomerase inhibitions［J］.Oncogene，2002，21(4):638

［7］李經(jīng)忠，王青青，余海.新型非病毒載體聚乙烯亞胺介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染參數(shù)的研究［J］.中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2006，25(4):481