多囊卵巢綜合征來(lái)源人胚胎干細(xì)胞系的建立及成脂分化*

孫瑩璞，王 芳，孔慧娟，白愛紅，趙 芳，李朋粉

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心鄭州450052

1998年美國(guó)科學(xué)家James Thomson和John Gearhart分別首次用體外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者捐贈(zèng)的胚胎和流產(chǎn)胎兒的生殖嵴細(xì)胞建立人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells，hESCs)系。此后，hESCs建系成功的報(bào)道日益增多。但有關(guān)多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)患者來(lái)源的hESCs細(xì)胞系的建立目前國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。

PCOS是育齡婦女最常見的生殖內(nèi)分泌疾病之一，也是引起育齡期婦女不孕的主要原因之一，但其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚。作者利用PCOS患者IVF-ET周期中廢棄胚胎和冷凍胚胎建立了我國(guó)首批PCOS來(lái)源的hESCs系，并定向分化為脂肪細(xì)胞，以期從干細(xì)胞水平探討PCOS的發(fā)病機(jī)制和干預(yù)措施。

1 材料與方法

選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心2007年6月至2008年7月期間的IVF-ET周期，共收集401例患者胚胎移植后廢棄的新鮮胚胎924枚和25例患者分娩后捐贈(zèng)的冷凍胚胎83枚，均為非PCOS患者。廢棄的新鮮胚胎包括:①卵裂期發(fā)育遲滯，不符合移植和冷凍標(biāo)準(zhǔn)的2個(gè)原核(pronucleus，PN)胚胎。②受精異常的無(wú)原核、單個(gè)原核和多個(gè)原核(≥3 PN，以3 PN為主)胚胎。依據(jù)2003年歐洲人類生殖與胚胎學(xué)會(huì)(ESHRE)和美國(guó)生殖醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)(ASRM)在鹿特丹會(huì)議上推薦的診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］診斷PCOS，共收集同期17例PCOS患者的59個(gè)新鮮廢棄胚胎和4例PCOS患者的19枚冷凍胚胎。在征得患者同意并簽署知情同意書后用于hESCs的建系實(shí)驗(yàn)。

將上述所得胚胎序貫培養(yǎng)共形成囊胚237枚，其中優(yōu)質(zhì)囊胚114枚。機(jī)械法分離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)，接種于混合飼養(yǎng)層(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞∶人包皮成纖維細(xì)胞數(shù)量比為1∶1)，傳代培養(yǎng)。將得到的胚胎干細(xì)胞進(jìn)行脂肪細(xì)胞的誘導(dǎo)分化，即在胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(α-MEM+體積分?jǐn)?shù)10%血清替代品)中添加10 mg/L胰島素、1 μmol/L地塞米松、0.5 mmol/L 1-甲基 3-異丁基黃嘌呤，另外添加不同濃度的羅格列酮和堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF)，反復(fù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳的培養(yǎng)體系和方法。

2 結(jié)果

2.1 建系情況 共建立hESCs 17株，其中PCOS來(lái)源5株，非PCOS來(lái)源12株。均在體外傳25代以上，對(duì)穩(wěn)定傳代的2種來(lái)源的hESCs進(jìn)行相關(guān)鑒定，結(jié)果顯示:所建立的hESCs具有干細(xì)胞的全部特性，光鏡下呈集落樣生長(zhǎng)(圖1)，表達(dá)堿性磷酸酶(AKP);細(xì)胞免疫熒光法檢測(cè)表面抗原階段特異性胚胎表面抗原(SSEA)-1均陰性，SSEA-4陽(yáng)性;RTPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)特異基因表達(dá)，可見轉(zhuǎn)錄因子OCT-4高水平表達(dá);懸滴法培養(yǎng)時(shí)，體外分化為擬胚體;將hESCs細(xì)胞注入SCID小鼠皮下或肌肉內(nèi)，可得到畸胎瘤;核型分析顯示核型均正常。

圖1 倒置顯微鏡下觀察到的hESCs克隆(×40)

圖2 誘導(dǎo)分化21 d的脂肪細(xì)胞(×40)

2.2 胚胎干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞的定向分化 建立了hESCs向脂肪細(xì)胞體外定向分化效率較高的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?10 μmol/L 羅格列酮聯(lián)合 5 μmol/L bFGF 后半周期誘導(dǎo)得到的脂肪細(xì)胞最多(圖2)。分化得到的脂肪細(xì)胞不僅具有脂肪細(xì)胞的形態(tài)，還有聚集甘油三酯及成熟脂肪細(xì)胞的功能。

3 討論

PCOS是育齡婦女最常見的一種復(fù)雜的內(nèi)分泌紊亂、糖代謝異常及脂代謝異常所致的病理狀態(tài)，以長(zhǎng)期無(wú)排卵、高雄激素血癥和胰島素抵抗為特征，5% ～10%的育齡婦女受到其困擾［2］。其對(duì)婦女健康的危害遠(yuǎn)非僅影響生殖功能。然而，迄今為止，PCOS的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。遺傳可能是其病因?qū)W上一個(gè)重要因素［3］。目前有研究［4］報(bào)道 PCOS病變起始于胚胎期，嬰兒且出生后對(duì)雄激素易感，在育齡期較早出現(xiàn)PCOS癥狀，說(shuō)明可能在干細(xì)胞階段PCOS胚胎的基因時(shí)空調(diào)控即存在差異位點(diǎn)。PCOS的遺傳特性及胚胎期異常提示可嘗試從hESCs著手，探究PCOS的發(fā)病機(jī)制、基因定位和治療等。采用PCOS來(lái)源的hESCs系進(jìn)行研究，可以摒除環(huán)境因素的影響，探討PCOS胚胎早期的遺傳變化。同時(shí)利用hESCs無(wú)限傳代的特性，可避免重復(fù)取患者組織或體液的痛苦，也可避免動(dòng)物模型的諸多弊端。目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)關(guān)于PCOS來(lái)源的hESCs建系成功的報(bào)道。作者經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn)，成功建立了穩(wěn)定的PCOS來(lái)源的 hESCs系，該細(xì)胞系具有干細(xì)胞的全部特征。

干細(xì)胞是一類具有自我更新、高度增殖和多向分化潛能的細(xì)胞群體。胚胎干細(xì)胞是最原始的干細(xì)胞，它位于個(gè)體發(fā)育的頂端，具有發(fā)育的全能性，可以分化成為人體中全部的組織細(xì)胞。但到目前為止，所有體外誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化的物質(zhì)只能提高某一分化組織在分化群落中的比例，不能誘導(dǎo)形成單一組織［5］。脂肪細(xì)胞的分化過(guò)程極其復(fù)雜，它包括有特殊的分化生長(zhǎng)因子參與的誘導(dǎo)環(huán)境的作用及相關(guān)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活。影響hESCs分化為脂肪細(xì)胞的因素眾多，選擇合適的細(xì)胞因子和激素，建立可靠穩(wěn)定的培養(yǎng)方案，才能有效提高h(yuǎn)ESCs的脂肪分化效率。

胰島素是一種促生長(zhǎng)因子，它是體內(nèi)唯一促進(jìn)脂類合成并抑制其水解的激素，能促進(jìn)前脂肪細(xì)胞聚集脂肪細(xì)胞分解釋放的脂滴以形成新的脂肪細(xì)胞;還能抑制腎上腺素和兒茶酚胺的脂解作用。地塞米松是糖皮質(zhì)激素的一種，主要是通過(guò)細(xì)胞核內(nèi)的糖皮質(zhì)激素作用元件發(fā)揮作用。羅格列酮可高選擇性激活核受體過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)。PPARγ不僅能促使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，引發(fā)脂肪細(xì)胞分化，還能維持成熟脂肪細(xì)胞的表型，在調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用［6］。bFGF是一種具有廣泛作用的生物活性物質(zhì)，具有促血管生成作用，對(duì)前脂肪細(xì)胞的增殖和分化可能起促進(jìn)作用［7］。作者在干細(xì)胞克隆已充分?jǐn)U增而尚未自發(fā)分化時(shí)，加入上述5種因子誘導(dǎo)hESCs向脂肪細(xì)胞定向分化，隨著分化時(shí)間的延長(zhǎng)，甘油三酯水平逐漸升高，在較短的時(shí)間內(nèi)使2種來(lái)源的hESCs均分化為成熟脂肪細(xì)胞。這為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS Consensus Workshop Group.Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long term health risks related to polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2004，81(1):19

［2］Allahbadia GN，Merchant R.Polycystic ovary syndrome in the Indian Subcontinent［J］.Semin Reprod Med，2008，26(1):22

［3］Legro RS，Strauss JF.Molecular progress in infertility:polycystic ovary syndrome［J］.Fertil Steril，2002，78(3):569

［4］Goodarzi MO. Lookingforpolycysticovary syndrome genes:rational and best strategy［J］.Semin Reprod Med，2008，26(1):5

［5］Kawano H，Cody RJ，Graf K，et al.AngiotensinⅡenhances integrin and alpha-actinin expression in adult rat cardiac fibroblasts［J］.Hypertension，2000，35(1 Pt 2):273

［6］Kereiakes DJ，Willerson JT.Metabolic syndrome epidemic［J］.Circulation，2003，108(13):1552

［7］王陽(yáng)，戚可名，馬越波.我院自體脂肪顆粒注射移植十年回顧［J］.中華整形外科志，2002，18(2):95