RNA干擾對人食管癌裸鼠移植瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子C表達(dá)的影響*

巴玉峰，宋一民，李 印#，張紅新，李素紅，陳奎生，張?jiān)茲h

1)河南省腫瘤醫(yī)院胸外科鄭州450003 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科;河南省腫瘤病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州450052

淋巴道轉(zhuǎn)移是人食管癌轉(zhuǎn)移的主要方式，且與患者的預(yù)后密切相關(guān)［1］。血管內(nèi)皮生長因子-C(vascular endothelial factor C，VEGF-C)可誘導(dǎo)淋巴管增生，促進(jìn)腫瘤淋巴道轉(zhuǎn)移，被稱為特異性的淋巴管 生 成 因 子［2］。RNA 干 擾 (RNA interference，RNAi)是一種新興的基因治療技術(shù)，具有高效性和高度特異性［3］。作者構(gòu)建了以人VEGF-C基因?yàn)榘袠?biāo)的小分子干擾RNA(siRNA)質(zhì)粒，經(jīng)陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人食管癌EC9706細(xì)胞，并移植于裸鼠皮下形成移植瘤，觀察移植瘤組織中VEGF-C的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討食管癌淋巴道轉(zhuǎn)移機(jī)制及以抗淋巴管生成為靶點(diǎn)的食管癌基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管癌EC9706細(xì)胞系(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))。T細(xì)胞免疫缺陷的BALB/c SPF SR雌性裸鼠25只(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所提供)，鼠齡4～6周，體質(zhì)量18～22 g。Trizol(Invitrogen公司)，RT-PCR一步法試劑盒(TaKaRa公司)，RT-PCR引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。VEGFC兔抗人多克隆抗體和SP免疫組化試劑盒均為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。RPMI 1640(?？寺∩锘瘜W(xué)制品北京有限公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)。HPIAS-1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)為同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像工程公司產(chǎn)品。馮氏IVC-Ⅱ型獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具(蘇州市馮氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備有限公司)。

1.2 siRNA轉(zhuǎn)染EC9706細(xì)胞 根據(jù)VEGF-C cDNA已知序列(NM_005429)，參照文獻(xiàn)［4］的方法，利用Ambion和TaKaRa等公司網(wǎng)站提供的設(shè)計(jì)分析軟件，設(shè)計(jì)并體外轉(zhuǎn)錄合成3條含19個(gè)核苷酸的siRNA(HX1、HX2和 HX3)和1條無關(guān)序列 siRNA(HX4)，序列見表1。

表1 寡核苷酸序列

導(dǎo)入pSINsi-U6載體，得到發(fā)卡樣siRNA表達(dá)重組質(zhì)粒。重懸EC9706細(xì)胞于RPMI 1640培養(yǎng)液中，以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h使之貼壁生長，當(dāng)融合達(dá)90%時(shí)，參照脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染試劑盒說明書分組進(jìn)行轉(zhuǎn)染，分別是空白對照組(僅加脂質(zhì)體)、pSINsi-U6-HX1組、pSINsi-U6-HX2組、pSINsi-U6-HX3組、無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染對照組。轉(zhuǎn)染48 h后，換含800 mg/L G418培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行抗性篩選，1周內(nèi)空白對照組和未轉(zhuǎn)染對照組細(xì)胞全部死亡，其余各組也有80% ～90%的細(xì)胞死亡，換用含400 mg/L G418培養(yǎng)液篩選抗性克隆至2周后，挑選陽性克隆，傳代至培養(yǎng)瓶中繼續(xù)常規(guī)擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.3 裸鼠移植瘤模型的建立 裸鼠隨機(jī)分為5組，分別為HX-1、2、3轉(zhuǎn)染組和無關(guān)序列轉(zhuǎn)染組以及未轉(zhuǎn)染對照組。將1.2中轉(zhuǎn)染siRNA質(zhì)粒的各組EC9706細(xì)胞傳代并常規(guī)擴(kuò)大培養(yǎng)，2 g/L胰蛋白酶消化、吹打、無菌生理鹽水重懸制成細(xì)胞懸液，注射于裸鼠腋窩皮下(2×106個(gè)/只)，動(dòng)物接種后3～5 d即可見到明顯腫塊突起，SPF環(huán)境中飼養(yǎng)4周后處死。

1.4 觀測指標(biāo)

1.4.1 移植瘤體積和質(zhì)量測定 頸椎脫臼處死荷瘤裸鼠，剝離移植瘤，洗凈并稱量。

1.4.2 移植瘤組織中VEGF-C蛋白檢測 采用免疫組化SP法測定，按照試劑盒說明操作。取移植瘤組織，常規(guī)制片，依次滴加工作液和VEGF-C多克隆抗體(稀釋度為1∶150)，中止反應(yīng)后蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。以PBS代替一抗作陰性對照，并按說明書推薦的結(jié)腸癌標(biāo)本作陽性對照。VEGF-C蛋白陽性染色為淡黃色或棕深黃色顆粒，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。每組切片用HPIAS-1000型高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)在高倍視野下計(jì)數(shù)10個(gè)視野，并避開移植瘤壞死區(qū)域，對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體視學(xué)參數(shù)——陽性單位(positive unit，PU)測定。PU越大，表示目標(biāo)物陽性表達(dá)強(qiáng)度越高;反之，表達(dá)強(qiáng)度越低［5］。

1.4.3 移植瘤組織中VEGF-C mRNA檢測 用Trizol提取移植瘤組織總RNA，RT-PCR檢測各組細(xì)胞中VEGF-C mRNA 的方法參照文獻(xiàn)［6］，VEGF-C 引物序列:上游 5’-AAGGAGGCTGGCAACATAAC-3’，下游5’-CCACATCTGTAGACGGACAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小 229 bp;β-actin引物序列:上游 5’-CATCCT GCGTCTGGACCT-3’，下游 5’-TCAGGAGGAGCAAT GATCTTG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小480 bp。目的基因與內(nèi)參照物引物同管擴(kuò)增，按以下條件進(jìn)行RT-PCR反應(yīng):50℃ 30 min，94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，57.8 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，共進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2 μL上樣緩沖液混勻，在12 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，紫外燈下觀察并用凝膠成像分析系統(tǒng)掃描，以VEGF-C與β-actin條帶灰度值的比值表示目的片段的相對表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 10.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。對5組移植瘤體積、質(zhì)量、VEGF-C蛋白的 PU及mRNA相對表達(dá)量進(jìn)行正態(tài)性、方差齊性檢驗(yàn)及單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

2.1 5組移植瘤體積及質(zhì)量的比較 見表2。

2.25 組移植瘤組織中VEGF-C mRNA的表達(dá)見圖1、表2。

圖1 移植瘤組織中VEGF-C mRNA的表達(dá)

2.3 5組移植瘤組織中VEGF-C蛋白的表達(dá) 見圖2與表2。

圖2 移植瘤組織中VEGF-C蛋白的表達(dá)(SP，×400)

表2 5組移植瘤體積、質(zhì)量、VEGF-C mRNA及蛋白測定結(jié)果(n=5)

3 討論

RNAi是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程，可以破壞特定目的基因轉(zhuǎn)錄的mRNA，使其功能沉默，而對其他正?；驘o影響。RNAi應(yīng)用不僅為基因功能研究提供了簡單有效的“基因敲除”手段，同時(shí)還為病毒感染性疾病、遺傳性疾病及腫瘤的基因治療開辟了新途徑［7］。

近年來，國內(nèi)對于VEGF-C與食管鱗狀細(xì)胞癌淋巴道轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究開展較多，均認(rèn)為食管鱗狀細(xì)胞癌組織中VEGF-C的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，且呈正相關(guān)［6，8-9］。謝曉斌等［10］應(yīng)用靶向 VEGF-C 的短發(fā)夾RNA(shRNA)對乳癌細(xì)胞生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)VEGF-C shRNA重組質(zhì)粒載體在乳癌MCF-7細(xì)胞中能高效、特異地發(fā)揮靶基因沉默作用。

作者將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染VEGF-C siRNA表達(dá)質(zhì)粒的食管癌EC9706細(xì)胞注射于裸鼠皮下，成功構(gòu)建了移植瘤，并用RT-PCR、免疫組化和體視學(xué)技術(shù)證明，轉(zhuǎn)染靶向VEGF-C的siRNA表達(dá)載體的EC9706細(xì)胞形成的移植瘤組織中VEGF-C mRNA和蛋白表達(dá)受抑，尤其是HX2轉(zhuǎn)染組移植瘤組織中不僅有VEGF-C蛋白與mRNA的表達(dá)下調(diào)，瘤組織體積和質(zhì)量也均有所減小，可能是由于VEGF-C系VEGF家族成員，該段序列與VEGF-A同源，從而發(fā)揮了抑制生長的生理功能，這也為針對VEGF-C的RNAi提供了一種新思路。HX1、2、3轉(zhuǎn)染組移植瘤組織中仍可檢出VEGF-C mRNA弱表達(dá)，可能與所用RNAi質(zhì)粒沉默VEGF-C mRNA表達(dá)的效率達(dá)不到100%有關(guān)。

總之，從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的角度證實(shí)，設(shè)計(jì)和構(gòu)建的抗VEGF-C表達(dá)的siRNA載體可有效抑制食管癌EC9706細(xì)胞產(chǎn)生VEGF-C的特性，為食管癌抗淋巴管生成的基因治療提供了理論依據(jù)。

［1］杜百廉.食管癌［M］.北京:中國科學(xué)技術(shù)出版社，1994:188

［2］Royston D，Jackson DG.Mechanisms of lymphatic metastasis in human colorectal adenocarcinoma［J］.J Pathol，2009，217(5):608

［3］Sledz CA，Williams BRG.RNA interference in biology and disease［J］.Blood，2005，106(3):787

［4］Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediates RNA interference in cultured mammlian cells［J］.Nature，2001，411(6 836):494

［5］牛海艷，申洪.ABCG2在肺癌中表達(dá)的定量研究［J］.中國體視學(xué)與圖像分析，2007，12(3):167

［6］張紅新，張嵐，賀付成.人食管鱗癌中血管內(nèi)皮生長因子C mRNA的表達(dá)及其臨床意義［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2006，16(24):3 697

［7］Ryther RC，F(xiàn)lynt AS，Phillips JA，et al.siRNA therapeutics:big potential from small RNAs［J］.Gene Ther，2005，12(1):5

［8］龍志強(qiáng)，李簡.食管鱗癌患者組織和血清中VEGF-C的表達(dá)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2006，41(2):362

［9］劉鵬飛，劉兵團(tuán)，沈衛(wèi)東，等.血管內(nèi)皮生長因子C與其受體在食管鱗癌中的表達(dá)及臨床意義［J］.世界華人消化雜志，2008，16(4):431

［10］謝曉斌，龍捷，楊芳，等.靶向血管內(nèi)皮生長因子C短發(fā)夾式RNA對人乳腺癌MCF-7細(xì)胞生物學(xué)特性的影響［J］.中華病理學(xué)雜志，2009，38(7):472