Eca109細(xì)胞光動力損傷效應(yīng)的傅里葉變換紅外光譜分析*

劉婉華，劉 健，刁振琦，李云濤，唐偉躍

1)鄭州大學(xué)物理工程學(xué)院鄭州450001 2)鄭州大學(xué)信息工程學(xué)院鄭州450001

光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是光敏劑進(jìn)入人體后，有選擇地聚集在腫瘤組織上，經(jīng)特定波長激光激發(fā)，在腫瘤組織內(nèi)發(fā)生一系列的光化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì)，如單線態(tài)氧、超氧陰離子及羥自由基等，作用于生物分子中的氧化敏感基團，導(dǎo)致其氧化失活，從而對蛋白質(zhì)、核酸和脂類生物大分子產(chǎn)生破壞作用，使細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死，達(dá)到治療腫瘤的目的。但是目前對PDT殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機制還未完全認(rèn)識。傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectrum，F(xiàn)TIR)主要研究分子振動光譜和轉(zhuǎn)動光譜，其光譜強度可反映樣本生化組成的定量信息，而光譜頻率則反映樣本分子的空間結(jié)構(gòu)、化學(xué)鍵等定性信息。FTIR的特點是掃描速度快，光通量大，分辨率高，信噪比高，測定光譜范圍寬，在分子生物學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。作者用FTIR技術(shù)分析光敏劑血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethyl ether，HMME)的光敏化作用對人食管癌細(xì)胞株Eca109生物大分子核酸、蛋白質(zhì)及脂類的微觀結(jié)構(gòu)的影響，從分子水平探討PDT對腫瘤細(xì)胞的損傷機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 HMME購自上海紅綠光敏劑研究所有限公司;Eca109購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所;RPMI 1640培養(yǎng)液購自美國Gibco公司。美國Nicolet IR200傅里葉變換紅外光譜儀;德國CHRIST冰凍干燥機，型號ALPHA1-2LD;光敏劑激發(fā)光源半導(dǎo)體激光器，英國DIOMED公司，波長630 nm，輸出功率2 W。

1.2 Eca109細(xì)胞的PDT處理 Eca109于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中傳代、培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗，制備密度為1×105mL－1的單細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)板中，分組培養(yǎng)，每組3個復(fù)孔。PDT組:將培養(yǎng)板放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，待其貼壁后，加入 5 mg/L的HMME，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，然后用半導(dǎo)體激光器垂直照射培養(yǎng)板，光劑量15 J/cm2，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，收集細(xì)胞進(jìn)行紅外光譜的采集。對照組不加光敏劑、不照射。

1.3 FTIR的采集及處理 將細(xì)胞制成溴化鉀壓片，放置于儀器中進(jìn)行檢測。參數(shù)設(shè)定:光譜掃描范圍400 ～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描累加次數(shù)128次。所得光譜均用Nicolet公司的Omnic 5.0專用軟件處理。采用Origin 7.5軟件對蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ進(jìn)行去卷積和二階導(dǎo)數(shù)處理，確定重疊峰子峰個數(shù)和峰位置，并對酰氨Ⅰ帶及其子峰進(jìn)行曲線擬合，根據(jù)各子峰占整個酰胺Ⅰ帶面積的比例計算蛋白質(zhì)各二級結(jié)構(gòu)的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 光譜圖 Eca109特征峰歸屬見表1［1-3］。2組的紅外光譜圖見圖1。可以看出，2組光譜譜型、譜峰和位置都存在很大的差異。

表1 Eca109紅外光譜特征峰及歸屬

圖1 2組紅外光譜圖

2.2 蛋白質(zhì)光動力損傷后的譜帶分析

2.2.1 蛋白質(zhì)分子C-O(H)伸縮振動譜帶 1 161 cm－1是蛋白質(zhì)C-O(H)鍵的伸縮振動譜帶，它主要來自蛋白質(zhì)分子中的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基C-O(H)基團的伸縮振動，光動力損傷后峰值向低波數(shù)頻移到1 158 cm－1。分子中C-O(H)基團一般與其他基團或分子形成氫鍵，吸收波數(shù)的頻移說明C-O(H)受約束程度降低，氨基酸殘基的C-O(H)基團某些氫鍵斷裂，氫鍵體系發(fā)生變化［4］。對蛋白質(zhì)來說，基團的損傷必然導(dǎo)致分子空間構(gòu)象受到破壞，蛋白質(zhì)變得松散。蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團的損傷主要受單線態(tài)氧作用，酪氨酸、色氨酸都含有芳香環(huán)，而單線態(tài)氧主要損傷芳香環(huán)［5］，此外單線態(tài)氧還可以作用于色氨酸的吲哚環(huán)［6］。

2.2.2 酰胺Ⅰ帶 酰胺Ⅰ帶(1 600～1 700 cm－1)常用來分析蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，它由代表羰基伸縮振動的幾個子帶組成，包含有α螺旋、β折疊、無規(guī)卷曲、β轉(zhuǎn)角等［7］，各組分的譜帶通常相互疊加在一起。圖2是結(jié)合去卷積、二階導(dǎo)數(shù)譜對原譜進(jìn)行曲線擬合得到的譜圖。2組二級結(jié)構(gòu)相對含量見表2。

圖2 酰胺Ⅰ帶二階導(dǎo)數(shù)譜

表2 2組蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的指認(rèn)［8］和平均相對百分含量值 %

可以看出，當(dāng)Eca109細(xì)胞光動力損傷后，蛋白質(zhì)的α螺旋含量減少12.4%，β折疊含量減少13.5%，表明蛋白質(zhì)主鏈的有序結(jié)構(gòu)減少。而無規(guī)卷曲和β轉(zhuǎn)角的含量分別上升49.6%和43.1%，提示蛋白質(zhì)無序性增加，蛋白質(zhì)主鏈構(gòu)象趨于松散。主鏈構(gòu)象發(fā)生變化的原因是光敏劑受激光照射后，產(chǎn)生的單線態(tài)氧具有較強的氧化性，破壞了形成α螺旋和β折疊的鏈內(nèi)和鏈間氫鍵體系，α螺旋和β折疊展開，被卷曲在蛋白質(zhì)分子內(nèi)的色氨酸等疏水芳香族殘基趨向蛋白質(zhì)表面［9］。說明光動力作用對Eca109細(xì)胞的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)造成明顯損傷，蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的改變使其失去活性，其結(jié)果影響細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，從病理學(xué)損傷效應(yīng)上表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡和壞死。

2.3 核酸光敏損傷后的譜帶分析 FTIR光譜中，譜帶969 cm－1是細(xì)胞內(nèi)磷酸化蛋白和核酸的磷酸單酯二價陰離子的對稱伸縮振動，反映細(xì)胞中核酸或磷酸化蛋白質(zhì)的含量。磷酸二酯基團的對稱伸縮振動 νs(PO2－)譜帶峰位于 1 084 cm－1附近，反對稱伸縮振動νas(PO2－)譜帶對應(yīng)于 1 244 cm－1。光動力損傷后969 cm－1峰變成了以975 cm－1為中心的一個寬峰，它對應(yīng)于各種各樣的由于DNA鏈斷裂產(chǎn)生的多核苷酸。νs(PO2－)譜帶 1 084 cm－1峰向高波數(shù)移動，由二階導(dǎo)數(shù)譜可知它變成了由1 089、1 078及1 072 cm－1組成的一組小峰，峰值強度均大幅下降。νas()譜帶1 244 cm－1峰的吸收強度也有所下降。譜帶反映核酸骨架上磷酸二酯基團結(jié)構(gòu)的變化，在完全無氫鍵時，磷酸二酯基團的反對稱伸縮振動在1 260 cm－1處，在完全氫鍵化后在 1 240 cm－1處［4］。1 244 cm－1峰向高波數(shù)移動，表明核酸骨架上磷酸二酯基團中形成氫鍵的程度減弱，氫鍵化程度的降低使細(xì)胞的核酸骨架從無序趨向于有序，細(xì)胞突變和異構(gòu)化受抑。磷酸二酯基團的吸收帶峰值的頻移和強度減小，說明核酸分子的構(gòu)象發(fā)生變化、含量降低，光動力損傷作用造成磷酸二酯基團的損傷，使 DNA單、雙鏈斷裂，癌細(xì)胞DNA復(fù)制能力被抑制，由此導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

2.4 脂質(zhì)光敏損傷后的譜帶分析 1 740 cm－1峰反映了細(xì)胞膜磷脂中羰基C=O基團的伸縮振動，峰位向高波數(shù)移動，吸收峰強度減弱，表明磷脂的構(gòu)象發(fā)生改變，碳?xì)滏滈g相互作用增強［10］。譜帶2 858和2 873 cm－1峰屬于磷脂脂質(zhì)中 CH2、CH3基團的對稱伸縮振動，而譜帶2 927和2 952 cm－1峰屬于CH2、CH3基團的反對稱伸縮振動。CH2和CH3基團伸縮振動譜帶反映膜磷脂分子內(nèi)碳?xì)滏湗?gòu)象的無序化程度［11］。光動力損傷后，2 858 cm－1峰峰值明顯減弱，峰位向高波數(shù)位移5 cm－1，說明磷脂分子碳?xì)滏湗?gòu)象的無序化和扭式構(gòu)型增加，細(xì)胞膜上多種功能基團結(jié)構(gòu)受損，從而使細(xì)胞膜完整性和流動性下降，膜功能受到嚴(yán)重影響。而細(xì)胞膜磷脂參與了細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此推測光動力作用所產(chǎn)生的單線態(tài)氧、羥基自由基等與細(xì)胞膜磷脂發(fā)生氧化反應(yīng)，引起細(xì)胞膜磷脂結(jié)構(gòu)改變，這可能是光動力作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機制之一。

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