自分泌運(yùn)動因子對EC9706、Eca109及EC-1細(xì)胞絲切蛋白磷酸化的影響*

陸玉成，閆紅霞，王莉莉，薛樂勛

鄭州大學(xué)生物系細(xì)胞生物學(xué)研究室鄭州450001

1986年Liotta等［1］從人黑色素瘤細(xì)胞株A2058血清培養(yǎng)基中分離、純化出一種由腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生和分泌的細(xì)胞因子，該細(xì)胞因子能刺激細(xì)胞的遷移和運(yùn)動，故被命名為自分泌運(yùn)動因子(autocrine motility factor，AMF)。已有研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，AMF 與許多實體瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。磷酸化絲切蛋白是普遍存在于真核細(xì)胞的一種肌動蛋白結(jié)合蛋白，參與調(diào)節(jié)肌動蛋白骨架的重組，從而影響細(xì)胞運(yùn)動能力。作者克隆人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞AMF基因，構(gòu)建真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞磷酸化絲切蛋白的表達(dá)情況，探討AMF的表達(dá)與絲切蛋白磷酸化之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株EC9706由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所分子腫瘤學(xué)國家重點實驗室惠贈，Eca109和EC-1由鄭州大學(xué)生物系細(xì)胞生物學(xué)研究室保存。pEGFP-C1和pcDNA 3.1(+)購自大連寶生物工程公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自美國Hyclone公司，絲切蛋白抗體購自美國Santa Cruz公司，抗His的單克隆抗體購自Sigma公司，β-actin多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，Trizol試劑及 LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。

1.2 真核表達(dá)載體 pEGFP-C1-AMF及 pcDNA 3.1(+)-AMF 的構(gòu)建

1.2.1 AMF基因的擴(kuò)增 根據(jù)GenBank登錄序列(NM_001184722.1)，利用 Primier primer 5.0 軟件設(shè)計引物，AMF引物序列:上游5＇-AGCTAAGCTTATG CATCATCATCATCATCATGCCGCTCTCACCCGGGAC C-3 ＇，下 游 5 ＇-ATCGGAATTCTTATTGGACTCTGGC CTCGCGCTGC-3＇，產(chǎn)物大小1 700 bp。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，68℃ 3 min 30 s，循環(huán)30次;72℃延伸10 min，4℃終止。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果，并送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 pEGFP-C1、pcDNA3.1(+)和AMF目的片段同時用HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切，純化酶切產(chǎn)物，將酶切后的AMF目的片段和載體片段以3∶1(物質(zhì)的量比)連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α后，挑選單個菌落并提取質(zhì)粒，獲得 pEGFP-C1-AMF 和 pcDNA3.1(+)-AMF，HindⅢ和EcoRⅠ雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，并送上海生工生物工程有限公司測序。

1.3 重組質(zhì)粒的表達(dá)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 EC9706、Eca109和EC-1細(xì)胞生長于含體積分?jǐn)?shù)10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到90%～95%融合時，采用LipofectamineTM2000分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-AMF和pcDNA3.1(+)-AMF，具體操作按說明書進(jìn)行。

1.3.2 轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-AMF細(xì)胞融合蛋白EGFPAMF的定位 pEGFP-C1-AMF轉(zhuǎn)染EC9706、Eca109和EC-1細(xì)胞48 h后，以藍(lán)光激發(fā)，用顯微熒光攝像/照相系統(tǒng)檢測EGFP-AMF融合蛋白的表達(dá)。

1.3.3 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-AMF 細(xì)胞 AMF mRNA檢測 應(yīng)用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞總RNA，取2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，PCR擴(kuò)增出目的基因片段，以β-actin為內(nèi)參，每個樣本重復(fù)3次。AMF引物同1.2.1;β-actin 引物序列:上游 5＇-ACCAACTGGGACGACATGGAGAAAATC-3 ＇，下 游 5 ＇-GTAGCCGCGCTCGGTGAGGATCTTCAT-3＇，產(chǎn)物大小 409 bp。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃1 min，循環(huán)30次;72℃延伸10 min，4℃終止。產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)攝像，以目的基因與β-actin條帶灰度值的比值表示目的基因的相對表達(dá)量。

1.3.4 轉(zhuǎn)染 pcDNA3.1(+)-AMF 細(xì)胞 AMF 蛋白的檢測 采用Western Blot法測定。用蛋白裂解液提取重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-AMF轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞的總蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每孔上樣量60 μg，常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，用鼠抗組氨酸標(biāo)簽的抗體作為一抗，山羊抗小鼠IgG抗體作為二抗進(jìn)行Western Blot分析，同時用β-actin作陽性對照。一抗(稀釋度1∶200)4℃過夜孵育及相應(yīng)二抗(稀釋度1∶10 000)37℃孵育1 h，ECL發(fā)光液處理后暗室內(nèi)曝光膠片。

1.4 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-AMF細(xì)胞磷酸化絲切蛋白的檢測 采用Western Blot法，操作同1.3.4。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-AMF、未轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染 pcDNA 3.1(+)的3種細(xì)胞中AMF mRNA及磷酸化絲切蛋白的相對表達(dá)量經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗后，采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 AMF基因PCR結(jié)果見圖1。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及測序分析證實，重組質(zhì)粒含有大小、方向和讀碼框均正確的插入片段(圖2)。

圖1 AMF基因PCR結(jié)果

圖2 重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.2 EGFP-AMF在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的定位 見圖3。藍(lán)光激發(fā)后，高倍鏡下可見轉(zhuǎn)染pEGFP-C1空載體的EC9706、Eca109和EC-1細(xì)胞綠色熒光分布于整個細(xì)胞，而轉(zhuǎn)染pEGFP-C1-AMF的細(xì)胞綠色熒光主要分布于細(xì)胞質(zhì)。

2.3pcDNA3.1(+)-AMF 轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 AMF mRNA及蛋白測定結(jié)果 見圖4、5和表1。

2.4 pcDNA3.1(+)-AMF轉(zhuǎn)染細(xì)胞中磷酸化絲切蛋白的表達(dá) 見圖6、表2。

圖3 EGFP-AMF在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的定位(×400)

圖4 pcDNA3.1(+)-AMF轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AMF mRNA的表達(dá)

表1 3組細(xì)胞中AMF mRNA的表達(dá)

圖5 pcDNA3.1(+)-AMF轉(zhuǎn)染細(xì)胞中AMF蛋白檢測結(jié)果

圖6 pcDNA3.1(+)-AMF轉(zhuǎn)染細(xì)胞中磷酸化絲切蛋白檢測結(jié)果

表2 3組細(xì)胞中磷酸化絲切蛋白的表達(dá)

3 討論

AMF是一個多功能蛋白，也可被稱為磷酸己糖異構(gòu)酶(phosphoglucose isomerase，PGI)［4］，催化葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)化為果糖-6-磷酸，PGI特異性抑制劑不僅可以抑制該酶的活性，也可以抑制細(xì)胞的運(yùn)動。AMF在細(xì)胞內(nèi)集中于像細(xì)管一樣的囊泡中，遍布于整個胞質(zhì)，而不是完全集中于某個特殊的細(xì)胞骨架網(wǎng)［5］。正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均能表達(dá)AMF，但在腫瘤細(xì)胞中存在AMF的過度表達(dá)并伴有蛋白選擇性分泌。研究［6-7］發(fā)現(xiàn)，AMF促進(jìn)腫瘤細(xì)胞運(yùn)動的功能是通過與腫瘤細(xì)胞上的自分泌運(yùn)動因子受體(AMFR)結(jié)合并活化Rho信號途徑來實現(xiàn)的［8］。作者構(gòu)建pEGFP-C1-AMF重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染3種食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，觀察到AMF蛋白均定位于細(xì)胞質(zhì)。

惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移包括了基質(zhì)降解、細(xì)胞遷移及血管生成等一系列步驟，其中腫瘤細(xì)胞在基質(zhì)中的遷移以及突破基底膜進(jìn)入血管是腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要途徑。在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，雖然細(xì)胞類型和分化程度的不同使癌細(xì)胞具有不同的轉(zhuǎn)移方式，但最終都是通過調(diào)節(jié)改變細(xì)胞骨架從而影響細(xì)胞的運(yùn)動。微絲微管的解離聚合由Rho家族的小GTP激酶調(diào)節(jié)，這些小GTP激酶將細(xì)胞外化學(xué)信號傳導(dǎo)至下游信號分子，最終作用于細(xì)胞骨架蛋白，影響微絲微管的解離聚合狀態(tài)，從而影響細(xì)胞的運(yùn)動能力［9］。絲切蛋白的活性依賴于Ser-3位點的磷酸化和去磷酸化，Ser-3位點的磷酸化使絲切蛋白失活、肌動蛋白微絲聚集，并增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動能力;反之，去磷酸化則激活絲切蛋白，解聚肌動蛋白微絲的活性［10］。作者構(gòu)建了 pcDNA3.1(+)-AMF 真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)3種細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，磷酸化絲切蛋白表達(dá)水平提高，提示AMF可以促進(jìn)絲切蛋白磷酸化，有利于進(jìn)一步提高癌細(xì)胞的運(yùn)動能力。

綜上所述，對AMF的進(jìn)一步研究將有助于闡明食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生及轉(zhuǎn)移機(jī)制，在此基礎(chǔ)上，抑制AMF的表達(dá)或活性可能為食管鱗狀細(xì)胞癌的防治提供一種新的治療模式［11］。

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