馬鈴薯青枯病菌生化型研究及菌株接種方法的比較

王曉丹，閔凡祥，郭 梅，胡林雙，魏 琪，董學(xué)志，李學(xué)湛

（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

馬鈴薯青枯病是由Ralstonia Solanacearum(RS)引起的一種世界性的重要細(xì)菌性病害，每年因此造成的產(chǎn)量損失大約為10%～15%，發(fā)病嚴(yán)重的地塊產(chǎn)量損失可達(dá)80%甚至絕產(chǎn)，給馬鈴薯生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重威脅。由于青枯病為細(xì)菌性病害，植株感病是系統(tǒng)性侵染，青枯病的藥劑防治十分困難。目前，防治青枯病最根本有效的方法是采用抗病品種，但是，馬鈴薯品種的抗病性對(duì)于不同的青枯菌系是有差異的[1]。因此鑒定和研究馬鈴薯青枯病菌生化型的組成和分布，將為加速我國(guó)馬鈴薯抗青枯病育種和病害綜合防治的工作進(jìn)程提供必要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的10個(gè)菌株分別來(lái)自我國(guó)山東、廣東和廣西3省。菌株全部從送檢至我單位的馬鈴薯青枯病樣品中分離純化獲得。菌株來(lái)源情況見(jiàn)表1。用于分離純化的培養(yǎng)基為2，3，5-氯化三苯基四氮唑干酪素選擇性培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)TZC）、用于純培養(yǎng)的培養(yǎng)基是基礎(chǔ)培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱(chēng)Kelman）[2]。

表1 供試菌株Table1 The tested strains

1.2 生化型鑒定

休和利夫森二氏培養(yǎng)基[3]：蛋白胨2 g、NaCl 5 g、K2HPO40.2 g、葡萄糖10.0 g、瓊脂6.0 g、1%溴百里酚藍(lán)溶液3 mL、蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2，分裝于試管中，115℃蒸汽滅菌20 min。滅菌后，分裝試管，高度約為4.5 cm。配置10%濃度的纖維二糖、乳糖、麥芽糖、己六醇、甘露醇和山梨醇溶液，分別過(guò)濾滅菌，加入涼至60℃的休和利夫森二氏培養(yǎng)基中，終濃度為1%。

以18～24 h幼齡菌種作種子，穿刺接種至休和利夫森二氏培養(yǎng)基中，每株 3支。同時(shí)以不接種的 3管培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照。30℃培養(yǎng) 1、2、3、7、14 d后，觀察結(jié)果。

1.3 生化型鑒定標(biāo)準(zhǔn)

若接種培養(yǎng)基產(chǎn)酸由橄欖綠變?yōu)辄S色并且陰性對(duì)照不變色的判斷為陽(yáng)性。生化型鑒定參照1964年Hayward[4]的劃分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，見(jiàn)表2。

1.4 青枯菌接種方法

以番茄作為接種植物，采用傷根灌注法和刺莖法2種方法進(jìn)行人工接種，并設(shè)清水對(duì)照，重復(fù)3次，篩選最佳接種方法。

（1）傷根灌注法：在溫室進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)穴盤(pán)育苗，在5～6片葉時(shí)期，在幼苗的一側(cè)，距根1 cm處用刀造成傷口，每株番茄苗在傷根部位灌注50 mL菌液（菌液濃度大約為1×109 cfu·mL-1）。將接種后的番茄苗放入人工氣候箱內(nèi)，設(shè)定溫度30℃，光照16 h，黑暗8 h，空氣濕度保持在80%以上，定期澆水，保持土壤濕潤(rùn)。若濕度無(wú)法達(dá)到，則可以用一個(gè)塑料袋包住植株，植株頂部將塑料袋開(kāi)一小口，以保持其濕度，促進(jìn)發(fā)病。在接種后7、14、21 d觀察發(fā)病情況。

表2 根據(jù)對(duì)雙糖的利用和己醇的氧化產(chǎn)生酸時(shí)為陽(yáng)性（+）對(duì)青枯菌分類(lèi)Table2 Classification of Ralstonia solanacearum based on the ability to utilize disaccharides and oxidize hexose alcohols producing acid when it is positive(+)

（2）刺莖法：將滅好菌的牙簽挑取青枯菌菌液若干，直接插到第3節(jié)葉腋處，每1株插1根，插牙簽時(shí)要注意不用插得太深，以免植株在未發(fā)病前就萎蔫死亡。放入人工氣候箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同上。

在接種后7、14、21、28 d，按Winstead等[5]分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級(jí)調(diào)查，共分5級(jí)，分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：0級(jí)：不發(fā)??；l級(jí)：1片葉感??；2級(jí)：2或3片葉感病；3級(jí)：除了頂端2～3片葉其余葉片均感?。?級(jí)：所有葉片感?。?級(jí)：植株完全死亡。

2 結(jié)果與分析

2.1 生化型測(cè)定

對(duì)來(lái)源于我國(guó)3個(gè)省份的從馬鈴薯寄主上分離的10個(gè)青枯病菌的生化型鑒定，結(jié)果見(jiàn)表3，測(cè)定結(jié)果可以看出：生化型Ⅱ和Ⅲ為優(yōu)勢(shì)種群，均占被測(cè)菌株的40%，生化型Ⅰ和生化型Ⅳ分別占10%。從地域上來(lái)看，被檢樣品中，我國(guó)山東省馬鈴薯青枯病菌生化型有3種，分別為生化型Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ；廣東省馬鈴薯青枯病菌生化型有2種，分別為生化型Ⅱ和Ⅲ；由于廣西省被檢樣品數(shù)量有限，發(fā)現(xiàn)1種生化型，為生化型Ⅰ。

2.2 病原菌接種

試驗(yàn)結(jié)果表明，利用傷根灌注法接種馬鈴薯青枯病菌的效果好于刺莖法。前者接種的番茄苗14 d內(nèi)均發(fā)病，發(fā)病較后者快；傷根灌注法接種的番茄苗發(fā)病級(jí)數(shù)都為4級(jí)，而刺莖法發(fā)病級(jí)數(shù)為2～3級(jí)。從操作難易程度來(lái)看，傷根灌注法比較簡(jiǎn)單，而刺莖法操作時(shí)要掌握好力度，容易傷及幼苗。因此，綜合分析，馬鈴薯青枯病接種方法以傷根灌注法較好。

表3 被測(cè)菌株生化型測(cè)定結(jié)果Table3 The classification results of tested strains

3 討論

青枯病菌生化型在我國(guó)不同地區(qū)和不同植物上的分布狀況是相當(dāng)復(fù)雜的，據(jù)國(guó)外資料記載在馬鈴薯上4種生化型都有存在[2]。本研究的被測(cè)馬鈴薯青枯病菌菌株包含了上述全部4種生化型。1985年，華靜月等[1]對(duì)我國(guó)8個(gè)省市的43個(gè)青枯菌菌株測(cè)定生化型，結(jié)果表明，供試的絕大部分菌株屬生化型Ⅱ，少數(shù)屬于生化型Ⅲ和Ⅳ。本研究中的優(yōu)勢(shì)種群為生化型Ⅱ和Ⅲ。從地域上看，本研究的被測(cè)廣東省菌株中，生化型Ⅲ為優(yōu)勢(shì)種群，占60%。曾憲銘等[6]測(cè)定廣東農(nóng)作物青枯病菌生化型的結(jié)果是其所測(cè)青枯病菌在馬鈴薯寄主上的生化型為Ⅱ、Ⅳ和Ⅲ-2。本研究中山東省馬鈴薯青枯病菌以生化型Ⅲ為優(yōu)勢(shì)種群，占50%，與丁愛(ài)云等[7]報(bào)道的山東省馬鈴薯青枯病菌以生化型Ⅲ為主的結(jié)果一致。

1976年Harris[8]認(rèn)為，可以把Hayward模式中的生化型進(jìn)一步劃分為亞型，自1984年華靜月等[9]研究報(bào)道了我國(guó)青枯病菌有生化亞型的存在，之后又有曾憲銘等[6]、丁愛(ài)云等[7]、徐莉莉等[10]報(bào)道了我國(guó)青枯病菌生化亞型的存在。在本研究中沒(méi)有測(cè)定到被測(cè)菌株中有生化亞型。

由于本研究的菌株數(shù)量有限，特別是廣西省收集到的菌株數(shù)量很少，因此本研究的結(jié)果尚不能代表上述3省份的所有馬鈴薯青枯病菌的生化型種類(lèi)及優(yōu)勢(shì)種群，有待于今后加大菌株的收集量，做更詳細(xì)地研究。

[1]華靜月,張長(zhǎng)齡,何禮遠(yuǎn).我國(guó)馬鈴薯青枯菌菌系和初步研究[J].植物病理學(xué)報(bào),1985,15(3):181-184.

[2]French E R,Gutarra L,Aley P,et al.Culture media for Pseudomonas solanacearum:Isolation,identification and maintenance[J].Fitopatologia,1995,30:126-130.

[3]東秀株,蔡妙英.常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2001.

[4]Hayward A C.Characteristic of Pseudomonas solanacearum[J].Appl Bact,1964,27(2):265-277.

[5]Winstead N,Kelman A.Inoculation technique for evaluating resistance to Psedomonas solanacearum[J].Phytopathology,1952,42:628-634.

[6]曾憲銘,董春.廣東農(nóng)作物青枯病菌的生化型[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,16(1):50-53.

[7]丁愛(ài)云,鄭繼發(fā),時(shí)呈奎,等.山東省植物青枯菌生化型研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,33(1):50-52.

[8]Harris D C.Bacterial wilt in Kenya with particular reference to potatoes[M]//Sequeira L,Kelman A.Proceedings of the first international planning conference and workshop on the ecology and control of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum.North Carolina State University,Raleigh,1976:84-88.

[9]華靜月,張長(zhǎng)齡,何禮遠(yuǎn).我國(guó)植物青枯菌的生化型和其他生理差異[J].植物保護(hù)學(xué)報(bào),1984,11(1):43-50.

[10]徐莉莉,尹燕妮,王勇明,等.發(fā)生于中國(guó)的青枯病菌生化變種研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2008(5):102-10.