15-脫氧前列腺素J2在大鼠缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用*

裴麗春,張一娜,張震環(huán),劉美玲,韓 晶,張艷橋

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué):1.附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院老年病科,哈爾濱150081;2.附屬第三臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)八科,哈爾濱150081)

腦卒中是許多發(fā)達(dá)國(guó)家致死和致殘的主要原因。在中國(guó),腦血管疾病是第3位致死因素,其中缺血性腦梗死占56.6%～80%,致殘率占第1位。在以前的研究中發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)參與了缺氧性神經(jīng)細(xì)胞損傷死亡的病理過(guò)程[1],過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-γ(PPA R-γ)參與了缺氧缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷死亡的病理過(guò)程[2]。環(huán)氧合酶-2的代謝產(chǎn)物 15-脫氧前列腺素 J2(15d-PGJ2)是 PPAR-γ的天然配體[3],本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用缺氧再?gòu)?fù)氧裝置,處理原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞,旨在探討 15d-PGJ2在大鼠缺氧神經(jīng)細(xì)胞損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 使用的原代培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞來(lái)自于新生24 h以?xún)?nèi)的Sprague-Dawle大鼠的乳鼠,所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二臨床醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)分別設(shè)對(duì)照組(未處理組)、缺氧再?gòu)?fù)氧組、不同濃度15d-PGJ2處理的缺氧再?gòu)?fù)氧組。

1.1.2 試劑 Neurobasal A、B27購(gòu)自 Life Technologies Inc(Rockville,M D),15d-PGJ2購(gòu)自Cayman Chemical Company。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取出生24 h內(nèi)的乳鼠放入75%的乙醇中消毒1～2 min后,用眼科剪刀迅速剪下鼠頭部,用冰 D-Hank′s液沖洗,剪開(kāi)顱腔,取出全腦,剝離皮層,仔細(xì)去除血管和腦膜。用手術(shù)剪刀將組織剪碎至1～3 mm大小。加入3～5倍體積的0.25%胰酶溶液,37℃水浴消化30 min,加入10%DMEM培養(yǎng)液終止消化,800 r/min離心5 min,棄上清液。加入10%DMEM培養(yǎng)液,用吸管輕輕吹打制成細(xì)胞懸液,靜止后吸取上清液過(guò)200目不銹鋼篩網(wǎng)。用10%DMEM培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞數(shù)為5×106/mL,接種至直徑為35 mm培養(yǎng)皿中,每個(gè)培養(yǎng)皿2 mL。37℃、5%CO2培養(yǎng)。24 h后換維持含Neurobasal A、B27的培養(yǎng)液,以后每3天半量換液。接種3 d時(shí)加入終濃度為 5～10 μ mol/L的阿糖胞苷以抑制膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。此方法培養(yǎng)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)鑒定證實(shí)95%為神經(jīng)元。

1.2.2 神經(jīng)細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧模型制備及分組 取培養(yǎng)第12天的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞,隨機(jī)分成3組,即空白對(duì)照組(未處理組)、二甲基亞砜(DMSO)對(duì)照組、15d-PGJ2+缺氧再?gòu)?fù)氧組(缺氧前 30 min 分別加入 0、1、5、10、25、50 μ mol/L 15d-PGJ2),然后置于缺氧罐(95%N2,5%CO2)內(nèi),37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后,將神經(jīng)細(xì)胞返回到37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中再?gòu)?fù)氧21 h。

1.2.3 M TT比色法測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞生存情況 取培養(yǎng)第12天,生長(zhǎng)在96孔培養(yǎng)皿中的原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞,不同分組處理后,將125 mg/mL的噻唑藍(lán)(M TT)40 μ L加入到每個(gè)孔中,37℃避光培養(yǎng)4 h后,每孔中加入 DMSO 150 μ L,振蕩 10 min,置于酶標(biāo)儀492 nm檢測(cè)吸光度A值,結(jié)果以對(duì)照組生存率的百分比表示。

1.2.4 DNA凝膠電泳法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況 培養(yǎng)第12天,生長(zhǎng)在100 mm培養(yǎng)皿中的原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞,經(jīng)不同分組處理后,細(xì)胞用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液洗滌1次,置于含有10 mmol/L Tris-鹽酸(pH=7.4),10 mmol/L EDT A及0.5%TritonX-100裂解液中裂解,超速離心,使用碘化鈉及乙醇在上清液中沉淀DNA,提取出的DNA在含1%～2%溴乙啶的1.2%瓊脂糖凝膠中電泳,DNA被溴乙啶著色,最后在紫外線(xiàn)燈下攝影,觀察凋亡的DNA在瓊脂糖凝膠電泳中所出現(xiàn)的梯形裂解條帶情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有影像用Scion Image軟件量化處理,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用Statview軟件的單因素方差分析(One-way ANOVA),以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞接種1 h內(nèi)開(kāi)始貼壁,絕大多數(shù)是單個(gè)分散的細(xì)胞。3～5 h細(xì)胞開(kāi)始變平,并且長(zhǎng)出突起。3 d后細(xì)胞胞體清晰明亮、豐滿(mǎn)、呈現(xiàn)錐體或星形;經(jīng)細(xì)胞突起生長(zhǎng)并形成網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)1周后,神經(jīng)細(xì)胞胞體進(jìn)一步增大,突起增粗并出現(xiàn)分支,此時(shí)神經(jīng)細(xì)胞已接近成熟,成熟神經(jīng)細(xì)胞邊界清楚,在倒置顯微鏡下可見(jiàn)明顯暈光(圖1)。培養(yǎng)2周后,神經(jīng)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)連接緊密,形態(tài)更加飽滿(mǎn),可以應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)研究(圖2)。

圖1 皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞(培養(yǎng)1周,×100)

2.2 神經(jīng)細(xì)胞特性鑒定 應(yīng)用抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)抗體對(duì)原代培養(yǎng)10 d的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行免疫 FRTIC標(biāo)記熒光實(shí)驗(yàn),每個(gè)樣本隨機(jī)選擇3個(gè)視野,分別計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞,判定原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞所占的比率。NSE抗體在培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)情況(圖3),其中在熒光顯微鏡下觀察呈現(xiàn)紅色熒光的即為 NSE陽(yáng)性細(xì)胞,即神經(jīng)元細(xì)胞。結(jié)果為培養(yǎng)的皮質(zhì)細(xì)胞中 NSE陽(yáng)性細(xì)胞(即神經(jīng)元細(xì)胞)占細(xì)胞總數(shù)的98.9%,提示原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞中所含的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量完全能滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)的需要。

圖2 皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞(培養(yǎng) 2周,×100)

圖3 NSE抗體在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)(×100)

2.3 15d-PGJ2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生存率影響的劑量反應(yīng)曲線(xiàn) 培養(yǎng)第12天的皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞,給予不同濃度15d-PGJ2處理30 min,給予缺氧2 h再?gòu)?fù)氧21 h處理,使用M TT測(cè)定法測(cè)定神經(jīng)細(xì)胞生存率。結(jié)果可見(jiàn),外源性15d-PGJ2在1～5μ mmol/L(低劑量)沒(méi)有明顯的保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用,而10 μ mmol/L(高劑量)以上則具有劑量依賴(lài)性保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用,神經(jīng)細(xì)胞生存率的上升情況在15d-PGJ2處理組與未處理組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05,P＜0.01)(圖4)。

圖4 外源性15d-PGJ2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞生存率影響的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)

2.4 15d-PGJ2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損傷作用研究結(jié)果 給予培養(yǎng)第15d-PGJ2預(yù)處理 30 min,再予以缺氧2 h再?gòu)?fù)氧21 h處理,用DNA凝膠電泳法檢測(cè)DNA核小體間斷裂情況。結(jié)果顯示,缺氧再?gòu)?fù)氧處理組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)典型的DNA梯形裂解條帶,而15d-PGJ2預(yù)處理組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞DNA的斷裂情況明顯減輕(圖5)。

圖5 DNA凝膠電泳法檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

3 討 論

腦血管疾病特別是缺血性卒中占長(zhǎng)期致殘疾病的第1位,嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康。對(duì)缺血性神經(jīng)細(xì)胞損傷的研究,一直以來(lái)是學(xué)術(shù)界研究的熱點(diǎn)。本研究在體外原代培養(yǎng)乳鼠神經(jīng)細(xì)胞中使用缺氧再?gòu)?fù)氧模型,模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷,并應(yīng)用15d-PGJ2進(jìn)行干預(yù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,15d-PGJ2在高劑量時(shí)具有劑量依賴(lài)性的保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用,且15d-PGJ2預(yù)處理組皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞DNA的斷裂情況明顯減輕。提示15d-PGJ2對(duì)神經(jīng)細(xì)胞缺氧性損傷起保護(hù)作用。

目前發(fā)現(xiàn)環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)有2種亞型:COX-1和COX-2。COX-2是花生四烯酸代謝中的關(guān)鍵限速酶,將花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎豀2(PGH2)[4-5],隨后在不同酶的作用下分別生成 PGE2、PGI2、PGD2、PGF2a和 TXA2等。15d-PGJ2是由前列腺素D2(PGD2)在體內(nèi)迅速通過(guò)脫水產(chǎn)生的具有的生物活性的 J2類(lèi)的前列腺素。有資料表明15d-PGJ2對(duì)腦缺血具有保護(hù)作用[6]。15d-PGJ2能明顯減少細(xì)胞凋亡,減少由于腦出血引起的炎癥、行為障礙、神經(jīng)元的丟失,促進(jìn)過(guò)氧化氫酶的表達(dá)[7]。15d-PGJ2保護(hù)腦組織免于缺血再灌注損傷[8]。15d-PGJ2對(duì)脊髓損傷起保護(hù)作用[9]。血清15d-PGJ2濃度的升高使近期與遠(yuǎn)期的神經(jīng)功能缺損相對(duì)輕于濃度低者,且梗死面積相對(duì)較小,15d-PGJ2對(duì)卒中患者起保護(hù)作用[1]。本實(shí)驗(yàn)在體外建立的神經(jīng)細(xì)胞缺氧再?gòu)?fù)氧模型上驗(yàn)證了15d-PGJ2具有劑量依賴(lài)性保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免于缺氧導(dǎo)致的死亡的作用,而且能減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡。因此,推斷15d-PGJ2參與了神經(jīng)細(xì)胞死亡的病理過(guò)程。

但有關(guān)15d-PGJ2是通過(guò)何種機(jī)制達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用機(jī)制迄今仍不清楚,有實(shí)驗(yàn)表明,15d-PGJ2能與PPAR-γ結(jié)合而影響著許多基因的轉(zhuǎn)錄而作用細(xì)胞周期[11]。但也有實(shí)驗(yàn)表明15d-PGJ2可能通過(guò)非PPAR-γ途徑對(duì)卒中起保護(hù)作用[12]。另有實(shí)驗(yàn)表明15d-PGJ2可能通過(guò)阻止小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)起到神經(jīng)保護(hù)作用[13]。對(duì)15d-PGJ2是通過(guò)何種機(jī)制達(dá)到保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的相關(guān)研究有待進(jìn)一步深入。

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