氨茶堿、地塞米松對(duì)哮喘患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制功能的影響

張 妍,周文英,鄔偉明,黃 瑾△

(中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院:1.呼吸科;2.中心實(shí)驗(yàn)室,廣東珠海519000)

支氣管哮喘的發(fā)病與Th1/Th2系統(tǒng)失衡和 Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化相關(guān),Th2型細(xì)胞因子IL-4可促進(jìn)IgE的產(chǎn)生,IL-5可促進(jìn)嗜酸性粒細(xì)胞的分化,IL-13可促進(jìn)黏液的分泌和誘導(dǎo)氣道高反應(yīng)性,從而介導(dǎo)哮喘氣道炎癥和氣道重塑過(guò)程。而Th1型細(xì)胞因子IFN-γ可抑制Th2型細(xì)胞的分化,被認(rèn)為對(duì)過(guò)敏性疾病的發(fā)生具有保護(hù)作用。但Th1/Th2理論并不能充分解釋哮喘的發(fā)病機(jī)制[1]。自CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞被首次報(bào)道以來(lái),這類(lèi)具有獨(dú)特免疫調(diào)節(jié)作用的專(zhuān)職調(diào)節(jié)細(xì)胞在自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)和過(guò)敏性疾病中的作用越來(lái)越受到重視。糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物和茶堿類(lèi)藥物均是目前治療哮喘的一線用藥。激素類(lèi)能有效控制氣道炎癥,茶堿類(lèi)能抑制磷酸二酯酶活性,使細(xì)胞內(nèi)cAMP增高從而引起支氣管擴(kuò)張,但有證據(jù)顯示茶堿在其血藥濃度尚未達(dá)到影響支氣管平滑肌張力時(shí)就可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[2]。本實(shí)驗(yàn)觀察哮喘患者及健康對(duì)照者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)Th1/Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響及激素類(lèi)藥物地塞米松和小劑量氨茶堿對(duì) CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞作用的影響,旨在進(jìn)一步探討哮喘患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的作用是否存在缺陷及不同藥物對(duì)其作用的影響,從而為哮喘的更有效控制提供依據(jù)。

1 臨床資料

1.1 研究對(duì)象 哮喘患者12例,男 7例,女 5例,平均年齡(33±11)歲。按《支氣管哮喘防治指南》[3]明確診斷,為本院門(mén)診及住院患者,均未使用茶堿類(lèi)藥物、糖皮質(zhì)激素類(lèi)藥物或停藥2周以上。健康成年人9例,平均年齡(28±12)歲,男5例,女4例,為本院健康志愿者。

1.2 主要試劑與儀器 完全培養(yǎng)基包括RPM I-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)、10%小牛血清(杭州四季清公司)、2mmol/L L-谷氨酰胺、10mmol/L HEPES、100u/mL青霉素、100u/mL鏈霉素等。氨茶堿、地塞米松購(gòu)自Sigma公司。淋巴細(xì)胞分離液(1.073g/mL)購(gòu)自上海恒信化學(xué)試劑有限公司。鼠抗人CD8純化抗體、鼠抗人CD25-純化抗體、羊抗鼠IgG免疫磁珠以及熒光抗體包括鼠抗人CD4-FITC、鼠抗人CD25-PE及鼠抗人IgG1-FITC/IgG1-PE購(gòu)自美國(guó)BD Pharmingen公司。抗CD3純化抗體、抗CD28純化抗體購(gòu)自北京晶美科技有限公司。人IL-5、IL-13、IFN-γELISA試劑盒購(gòu)自深圳達(dá)科為生物科技有限公司。FACS Calibur型流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司。酶標(biāo)儀購(gòu)自INSTRUMENTS.INC公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 外周血CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的分離[4]采集哮喘患者及健康對(duì)照者外周靜脈血30mL,分離、洗滌外周血單核細(xì)胞,并用尼龍棉柱分離出T淋巴細(xì)胞。按2μ g/107個(gè)細(xì)胞加入鼠抗人CD8純化抗體,37℃下孵育30min,1 000r/min離心5min,棄上清液中未結(jié)合的抗體,按 120μ g/107個(gè)細(xì)胞加入羊抗鼠IgG免疫磁珠,在37℃下反應(yīng)30min,間隔 10min輕輕晃動(dòng)反應(yīng)管。接著加入3mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,用磁分離器分離8min,收集未被免疫磁珠結(jié)合的細(xì)胞懸液至另一干凈管中,所得即為CD4+T淋巴細(xì)胞。取分離后的CD4+T淋巴細(xì)胞,按前分離方法及添加比例依次加入鼠抗人CD25純化抗體、羊抗鼠IgG免疫磁珠,用磁分離器分離,收集未被磁珠結(jié)合的細(xì)胞即為CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞,被磁珠結(jié)合的細(xì)胞即為CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞。取105個(gè)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞加入抗CD4-FITC及抗CD25-PE標(biāo)記,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)[4]雙陽(yáng)性細(xì)胞的純度為81.3%～89.8%,可用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞與CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞的體外培養(yǎng)及藥物干預(yù) 以1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度,置96孔板培養(yǎng),設(shè)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞組(2.5×104/孔)、CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞組(105/孔)及CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞聯(lián)合CD4+CD25-T覆水難收細(xì)胞組(2.5×104+105/孔),第3組又分為氨茶堿干預(yù)組(5mg/L)、地塞米松干預(yù)組(10-5mol/L)及空白對(duì)照組,各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每孔另外添加抗CD3純化抗體(10μ g/mL)及抗 CD28純化抗體(10μ g/mL),調(diào)整每孔體積為200μ L。為避免添加藥物對(duì)CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生影響,參照Dao Nguyen和 Robinson[5]的處理方法,先予氨茶堿、地塞米松及平衡液預(yù)處理CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞,置 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi) 12h后,以 1640完全培養(yǎng)基離心洗滌CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞以去除干預(yù)藥物對(duì)后續(xù)培養(yǎng)的影響。細(xì)胞接種后培養(yǎng)72h,取培養(yǎng)上清液100μL,-20℃保存,用于細(xì)胞因子的檢測(cè)。

1.3.3 IL-5、IL-13及IFN-γ水平的檢測(cè) 嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,測(cè)吸光度(A450nm)值,通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算培養(yǎng)上清液中各細(xì)胞因子的含量,結(jié)果以pg/mL表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)以表示,采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及配對(duì)樣本t檢驗(yàn),以 P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分離得的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞純度檢測(cè) CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞純度為81.3%～89.8%,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)分離得的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞純度

2.2 哮喘患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 IFN-γ、IL-5、IL-13水平測(cè)定 詳見(jiàn)表1。哮喘患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞能有效抑制CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞生成 IFN-γ、IL-5(P＜0.01),對(duì)IL-13的合成無(wú)顯著抑制作用;采用地塞米松預(yù)處理CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞后,CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制IL-5、IL-13生成能力增強(qiáng)(P＜0.01);采用氨茶堿預(yù)處理后,CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制IL-5生成的能力增強(qiáng)(P＜0.01)。

表1 哮喘患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測(cè)定(n=12pg/mL)

表1 哮喘患者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測(cè)定(n=12pg/mL)

組別 IFN-γ IL-5 IL-13 CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞組 1.84±0.71 1.54±0.59 1.60±0.88 CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞組 45.76±8.20 67.13±9.89 85.55±10.58空白對(duì)照組 35.03±5.64 59.20±9.30 81.58±6.18地塞米松干預(yù)組 34.25±9.26 38.08±8.01 75.48±6.03氨茶堿干預(yù)組 37.53±7.51 38.63±8.28 79.94±6.28

表2 健康對(duì)照者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測(cè)定(n=9,pg/mL)

表2 健康對(duì)照者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測(cè)定(n=9,pg/mL)

與空白組比較,*:P＜0.05,▲:P＜0.01;CD4+CD25+T細(xì)胞組未參與比較。

組別 IFN-γ IL-5 IL-13 CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞組 1.64±0.41 1.46±0.60 1.30±0.48 CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞組 48.00±7.96▲ 53.81±6.92▲ 79.90±6.21▲空白對(duì)照組 35.31±3.77 42.71±5.17 55.01±10.75地塞米松干預(yù)組 31.01±5.24* 29.96±2.81▲ 45.71±6.27▲氨茶堿干預(yù)組 38.96±5.32 31.78±4.39▲ 46.79±6.64*

2.3 健康對(duì)照者細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IFN-γ、IL-5、IL-13水平測(cè)定 詳見(jiàn)表2。健康對(duì)照者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞能有效抑制CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞生成 IFN-γ、IL-5及IL-13(P＜0.01);采用地塞米松預(yù)處理后,CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制IFN-γ(P＜0.05)、IL-5(P＜0.01)及 IL-13(P＜0.01)生成的能力顯著增強(qiáng);采用氨茶堿預(yù)處理后,CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制IL-5(P＜0.01)、IL-13(P＜0.05)生成的能力亦顯著增強(qiáng)。

3 討 論

目前大量研究提示CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用。Kearley等[6]證實(shí):CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞可以抑制氣道嗜酸性粒細(xì)胞的聚集及Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生。Ling等[7]研究發(fā)現(xiàn),枯草熱患者體內(nèi)分離的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制細(xì)胞增殖的能力在非花粉傳授季節(jié)是降低的,在花粉傳授季節(jié)更低。而Grindebacke等[8]發(fā)現(xiàn)雖然來(lái)自過(guò)敏癥者和非過(guò)敏癥者的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞在花粉傳授季節(jié)均可以有效地抑制T細(xì)胞的增殖,但是過(guò)敏癥者的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞不能有效抑制花粉誘導(dǎo)的Th2型細(xì)胞因子的產(chǎn)生,但可抑制 Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)的產(chǎn)生。推測(cè)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞可通過(guò)抑制CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞過(guò)度增殖、抑制Th2型細(xì)胞因子過(guò)度產(chǎn)生,在哮喘的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。而哮喘患者體內(nèi)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞存在功能缺陷,從而介導(dǎo)哮喘發(fā)病。但也有相反的觀點(diǎn),Shi等[9]將CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞與CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞共同培養(yǎng)時(shí),發(fā)現(xiàn)健康者和哮喘患者提供的細(xì)胞均被抑制,來(lái)自健康者和哮喘患者的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的抑制功能沒(méi)有差別。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),哮喘患者外周血分離的 CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞可有效抑制Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)的分泌,并可有效抑制 Th2型細(xì)胞因子(IL-5)的分泌,而對(duì)IL-13的分泌則無(wú)明顯抑制作用。健康者分離的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)及Th2型細(xì)胞因子(IL-5、IL-13)的產(chǎn)生均有抑制作用。提示哮喘患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞在抑制Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生的功能上存在部分缺陷。

糖皮質(zhì)激素是治療哮喘的一線用藥,關(guān)于其對(duì) CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的影響,目前已有部分研究。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)給BA LB/c小鼠注射地塞米松后,小鼠淋巴器官尤其是胸腺中CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)量及CD4+CD25+/CD4+CD25-T淋巴細(xì)胞比例均升高。CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞和CD4+CD25-T細(xì)胞對(duì)地塞米松表現(xiàn)出不同的凋亡反應(yīng),IL-2可選擇性地保護(hù)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞,地塞米松對(duì)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的調(diào)節(jié)可能參與其抗炎及免疫抑制作用[10]。Dao Nguyen和 Robinson[5]在體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,激素預(yù)處理的CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞在隨后與抗原誘導(dǎo)的CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí),具有更強(qiáng)的抑制增殖的能力,該效應(yīng)見(jiàn)于健康者及過(guò)敏癥者,后者增強(qiáng)的程度稍低。本實(shí)驗(yàn)中,采用地塞米松預(yù)處理CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞后,哮喘患者和健康對(duì)照者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制Th2型細(xì)胞因子(IL-5、IL-13)分泌的能力均顯著增強(qiáng),健康對(duì)照者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制IFN-γ產(chǎn)生的能力亦增強(qiáng)。提示地塞米松可增強(qiáng)健康對(duì)照者及哮喘患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制 Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力,且兩者對(duì)地塞米松的反應(yīng)性無(wú)差異;地塞米松還增強(qiáng)健康對(duì)照者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制Th1型細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。推測(cè)激素類(lèi)藥物控制哮喘發(fā)作的機(jī)制之一可能是通過(guò)增強(qiáng)CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)Th2型反應(yīng)的抑制能力來(lái)發(fā)揮作用,且哮喘患者與健康對(duì)照者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)激素治療的反應(yīng)無(wú)顯著差別。

氨茶堿也廣泛應(yīng)用于治療哮喘方面。近年研究發(fā)現(xiàn)小劑量氨茶堿對(duì)哮喘患者有顯著的抗炎作用[2]。Jaffar等[11]發(fā)現(xiàn)在給予哮喘患者小劑量氨茶堿后,其氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)程度降低,CD4+T細(xì)胞比例降低。Nie等[12]在對(duì)接受小劑量氨茶堿規(guī)律治療的哮喘患者的痰液研究后發(fā)現(xiàn),痰中嗜酸性粒細(xì)胞比例降低,IL-5水平下降,但CD4+T細(xì)胞比例及IFN-γ水平無(wú)顯著變化。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)小劑量氨茶堿預(yù)處理CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)健康對(duì)照者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制Th2型細(xì)胞因子(IL-5、IL-13)能力顯著增強(qiáng),而哮喘患者僅對(duì)IL-5抑制能力增強(qiáng),兩者抑制IFN-γ生成的能力均無(wú)顯著改變。提示小劑量氨茶堿可增強(qiáng)健康者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力,從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,氨茶堿對(duì)哮喘者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞的抑制能力也有增強(qiáng),但增強(qiáng)程度不如前者。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為與健康對(duì)照者比較,哮喘患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞在抑制Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生方面存在部分功能缺陷;地塞米松可增強(qiáng)健康者和哮喘患者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞抑制Th2型細(xì)胞因子的能力,且兩者對(duì)該藥物反應(yīng)無(wú)差別;氨茶堿也可增強(qiáng)健康者和哮喘者CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞對(duì)Th2型細(xì)胞因子產(chǎn)生的抑制,但哮喘者對(duì)該藥物反應(yīng)性不如健康者。從而為進(jìn)一步研究CD4+CD25+T調(diào)節(jié)細(xì)胞與哮喘發(fā)病的關(guān)系及治療哮喘藥物發(fā)揮作用的機(jī)制方面提供依據(jù)。

[1]van Oosterhout AJ,Motta AC.Th1/Th2 paradigm:not seeing the forest for the trees?[J].Eur Respir J,2005,25(4):591.

[2]Barnes PJ.Theophylline:new perspectives for an old drug[J].Am J Respir Crit Care Med,2003,167(6):813.

[3]中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組.支氣管哮喘防治指南(支氣管哮喘的定義、診斷、治療和管理方案)[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2008,31(3):177.

[4]Wichlan DC,Roddam PL,Eldridge P,et al.Efficient and reproducible large-scale isolation of human CD4+CD25+regulatory T cells with potent suppressor activity[J].J Immunol Methods,2006,315(1-2):27.

[5]Dao Nguyen X,Robinson DS.Fluticasone propionate increases CD4+CD25+T regulatory cell suppression of allergen-stimulated CD4+CD25-T cells by an IL-10-dependent mechanism[J].J Allergy Clin Immunol,2004,114(2):296.

[6]Kearley J,Robinson DS,Lloyd CM.CD4+CD25+regulatory T cells reverse established allergic airway inflammation and prevent airway remodeling[J].J Allergy Clin Immunol,2008,122(3):617

[7]Ling EM,Smith T,Nguyen XD,et al.Regulation of CD4+CD25+regulatory T-cell suppression of allergen-driven T-cell activation at atopic status and express of allergic diseases[J].Lancet,2004,363(9409):608.

[8]Grindebacke H,Wang K,Andersson AC,et al.Defective suppression of Th2 cytokines by CD4+CD25+regulatory T cells in birch allergics during pollen season[J].J Clin Exp Allergy,2004,34(9):1364.

[9]Shi HZ,Li S,Xie ZF,et al.Regulatory CD4+CD25+T lymphocytes in peripheral blood from patients with atopic asthma[J].Clin Immunol,2004,113(2):172.

[10]Chen X,Murakami T,Oppenheim JJ,et al.Differential response of murine CD4+CD25+and CD4+CD25-T cells to dexamethasone-induced cell death[J].Eur J Immunol,2004,34(3):859.

[11]Jaffar ZH,Sullivan P,Page C,et al.Low-dose theophylline modulates T-lymphocyte activation in allergen-challenged asthmatics[J].Eur Respir J,1996,9(3):456.

[12]Nie HX,Yang J,Hu SP,et al.Effects of theophylline on CD4+T lymphocyte,interleukin-5,and interferon gamma in induced sputum of asthmatic subjects[J].Acta Pharmacol Sin,2002,23(3):267.