依達(dá)拉奉改善大鼠血腦屏障損傷的AQP-4機制研究

張 衍 王煥成 宋明愛

河南南陽市第一人民醫(yī)院 南陽 473000

腦出血(intracerebral hemorrhage,ICH)腦水腫是影響患者病情程度及預(yù)后的重要因素,而后期血腦屏障損傷引起的血管源性腦水腫是主要的原因。由于伊文斯藍(lán)具有不能透過血腦屏障的特性,本實驗以檢測腦組織中伊文斯藍(lán)(EB)含量來分析腦出血后血腦屏障和AQP-4的關(guān)系,進一步探討依達(dá)拉奉改善腦出血大鼠血腦屏障損傷的AQP-4機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年S-D雄性大鼠90只,由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供,體質(zhì)量280～300g。標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)和自由飲水,保持室溫20～25℃及恒定的濕度。按數(shù)字表隨機分為對照組、模型組、依達(dá)拉奉組各30只。每組在隨機分為術(shù)后6h、1d、3d、5d、7d 5個時相點,每個時相點下 6 只。

1.2 實驗方法 (1)模型組:以4%水合氯醛300mg/kg腹腔麻醉。參考Hua等[1]方法固定大鼠。頭正中切約lcm的縱切口,暴露前囟,使微量注射儀套管尖端移至前囟前0.5mm,左側(cè)中線旁 3mm,用大針頭鉆孔,穿透顱骨。用40℃水溫浴鼠尾約10min取出擦干,在距鼠尾末端約5mm處剪斷,用微量注射儀吸新鮮血液約50μ l,迅速插入鉆好的孔內(nèi),向內(nèi)進針6mm。在 2.5min內(nèi)注入,留針5min后緩慢退針。拔針后無血液自針道返流,蘇醒后出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀視為造模成功。(2)對照組:前期操作同模型組,但不注血液。(3)依達(dá)拉奉組:建模前每隔12h腹腔注射依達(dá)拉奉2mg/kg直到相應(yīng)的時相點,對照組及模型組用等量的生理鹽水腹腔注射。

1.3 檢測方法

1.3.1 干鮮質(zhì)量的測定:取血腫中心前半分區(qū)腦組織,準(zhǔn)確稱重置于100～110℃的烤箱中烘烤24 h至恒重后,稱取干質(zhì)量,根據(jù)公式:腦組織含水量(%)=(鮮質(zhì)量-干質(zhì)量)/鮮質(zhì)量來計算,精確度為0.1。

1.3.2 血腦屏障通透性測定:采用伊文思藍(lán)甲酰胺法,大鼠處死前1 h經(jīng)尾靜脈注入2%EB(2ml/kg),稱取血腫內(nèi)側(cè)部分置于甲酰胺(1ml/100g腦組織)中60℃孵育 24h。1000 r/min,離心5min,分光光度計(λ=632nm)測定上清液OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出EB含量。

1.3.3 AQP-4免疫組化檢測:常規(guī)脫水,加一抗 AQP-4(1∶50),加生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG,脫片,顯微鏡下觀察。棕黃色為強陽性,黃色為陽性,淺黃色為弱陽性,與間質(zhì)顏色一致者為陰性。隨機采集5個高倍視野(10×40),采用雙盲法計算每個高倍鏡視野AQP-4陽性細(xì)胞表達(dá)率。

2 結(jié)果

見表 1、2、3、4。

表1 腦出血后不同時間點腦含水量 ()

表1 腦出血后不同時間點腦含水量 ()

注:與假手術(shù)組比較,*P＜0.05;與ICH組同一時間點比較,#P＜0.05

組別 n腦含水量(%)6h 1d 3d 5d 7d對照組 30 79.26±0.75 79.27±0.77 79.27±0.70 79.28±0.75 79.26±0.71模型組 30 79.96±0.68 83.38±0.55 84.15±0.61 83.65±0.52 81.70±0.37依達(dá)拉奉組 30 79.78±0.40 80.02±0.31* 82.25±0.49*# 80.12±0.50*# 79.70±0.58#

表2 腦出血后不同時間點腦組織EB含量 ()

表2 腦出血后不同時間點腦組織EB含量 ()

組別 n 腦組織EB含量(OD/g)6h 1d 3d 5d 7d對照組 30 0.308±0.006 0.308±0.056 0.310±0.034 0.309±0.028 0.307±0.030模型組 30 0.585±0.085* 0.879±0.086* 0.792±0.051* 0.569±0.097* 0.447±0.09*依達(dá)拉奉組 30 0.359±0.071#* 0.593±0.052*# 0.527±0.049*# 0.385±0.044*# 0.291±0.039*

表3 腦出血后不同時間點腦組織AQP-4表達(dá)含量 ()

表3 腦出血后不同時間點腦組織AQP-4表達(dá)含量 ()

組別 n 腦組織AQP-4表達(dá)率(%)6h 1d 3d 5d 7d對照組 30 16.98±0.90 16.98±1.00 16.98±0.96 16.98±0.99 16.98±0.98模型組 30 19.48±0.65 26.56±1.44* 43.34±2.73* 49.86±1.76* 20.47±1.41*依達(dá)拉奉組 30 18.42±0.26 23.37±1.56*# 40.54±2.14*# 45.04±1.97*# 18.32±1.79#

表4 EB含量與AQP-4表達(dá)的相關(guān)分析

3 討論

AQP-4是近年來研究比較多的一類水特異性膜內(nèi)在蛋白,為水分子跨膜轉(zhuǎn)運提供了一個全新的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),對于維持機體的水平衡起著重要作用,并且與水平衡紊亂所造成的一些疾病有密切關(guān)系[2]。AQP-4廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞膜、蛛網(wǎng)膜下腔、血管周圍的膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞、脈絡(luò)叢及下丘腦滲透壓感受區(qū)器官,并認(rèn)為其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)作為滲透壓感受器有介導(dǎo)和調(diào)節(jié)水的運輸和平衡的作用。在生理條件,水通道基本上是處于激活狀態(tài),水轉(zhuǎn)運過程很快,一般不需門控和其他調(diào)節(jié),而在腦出血后6 h,水腫區(qū)的陽性細(xì)胞數(shù)增多,陽性細(xì)胞體積增大,AQP-4表達(dá)增強,第 3天達(dá)高峰,此后逐漸回落,但 1周后仍明顯高于正常。已有研究表明,AQP-4不僅參與腦組織水代謝的生理和病理過程,而且可能與調(diào)節(jié)腦脊液的形成及細(xì)胞外液容積的變化有關(guān),參與腦水腫的多種生理、病理過程發(fā)生腦水腫時AQP-4表達(dá)增加,是星形膠質(zhì)細(xì)胞適應(yīng)細(xì)胞外環(huán)境變化的反應(yīng),同時AQP-4又促進了星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫的發(fā)生和發(fā)展,而AQP-4表達(dá)的下調(diào)或缺陷對減輕腦水腫程度、降低病死率和致殘率有重要作用。這顯示AQP-4在腦組織水的運輸中起關(guān)鍵性作用,且提示調(diào)節(jié)AQP-4變化可能為減輕各種腦疾病所致腦水腫提供新的治療方法。

腦出血后腦水腫主要是血腦屏障受損,通透性增加,血漿滲出引起的血管源性腦水腫。本實驗顯示腦出血后血漿中AQP-4的濃度出現(xiàn)了明顯的增高,隨著AQP-4含量的增高,腦水腫也隨之明顯加重,到 72h達(dá)高峰。表明 AQP-4的大量產(chǎn)生與腦水腫發(fā)生之間有一定的關(guān)系。本實驗結(jié)果還顯示,腦出血后AQP-4的濃度從6h逐漸增高,腦水腫的變化趨勢與之大致相同,5d達(dá)峰值,7d開始下降。腦出血組腦組織EB含量在腦出血后6h上升,1～3d達(dá)到高峰后緩慢下降,1d與 3d相比無顯著性差異(P＞0.05),推測 BBB通透性的高峰出現(xiàn)在1～3d。BBB通透性與AQP-4表達(dá)的相關(guān)分析顯示二者呈顯著正相關(guān),表明腦出血后AQP-4表達(dá)的上調(diào)可能引起B(yǎng)BB的開放,使BBB通透性增加。腦含水量在腦出血后6h也開始升高,3d達(dá)到高峰,之后開始下降,7d仍然高于正常,與AQP-4表達(dá)的變化一致,二者呈顯著正相關(guān),與文獻報道一致。腦出血后AQP-4表達(dá)水平和腦含水量在相應(yīng)時間點上均高于對照組,提示AQP-4表達(dá)的上調(diào)導(dǎo)致腦含水量的增加,說明AQP-4與腦出血后腦水腫的形成有密切關(guān)系。本實驗中依達(dá)拉奉組與出血組相比,BBB通透性高峰出現(xiàn)的時間趨于一致,但峰值明顯降低,其他時間點腦組織內(nèi)EB含量也低于腦出血組,表明依達(dá)拉奉能顯著降低BBB的通透性,依達(dá)拉奉組AQP-4表達(dá)及腦含水量在各時間點均低于腦出血組,說明應(yīng)用依達(dá)拉奉能夠降低腦出血后腦內(nèi)AQP-4的表達(dá)及腦含水量。

自由基清除劑依達(dá)拉奉是目前臨床試驗證明惟一有效的自由基清除劑[3],具有自由基清除和抑制脂質(zhì)過氧化的作用,可以抑制腦細(xì)胞(血管內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞)的過氧化作用,靜脈給藥后可清除腦內(nèi)的具有高度細(xì)胞毒性的羥基基團。體內(nèi)試驗顯示[4],依達(dá)拉奉還能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞損害,抑制腦水腫、改善神經(jīng)功能。

[1]Hua Y,Schallert T,Keep RF,et al.Behavioral test after intracerebral hemorrhage in the rat[J].Stroke,2002,33(10):2478-2484.

[2]Kiening KL,Frank KH,Landeghem V,et al.Decreased hemispheric aquaporin-4 is linked to evolving brain edema following controlled cortical impact injury in rats[J].Neuroscience Letters,2002,324(2):105-108.

[3]渡邊俊明,幸敏志,齊藤健一,等 .新規(guī)腦保護藥 MCI-186藥理學(xué)的檢討[J].藥理與治療,1997,25(suppl7):S181-S188.

[4]陳勇,高樸,常娜,等.依達(dá)拉奉治療腦出血的臨床療效觀察[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2008,11(6):104-105.