中藥植物金線吊烏龜對植物病原真菌的抗菌活性

玉艷珍, 鄧業(yè)成, 張 明, 覃 旭, 李麗芬, 駱海玉

(廣西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,桂林 541004)

金線吊烏龜(Stephania cepharantha Hayata)為防己科千金藤屬植物,分布于我國的大部分地區(qū),生長在村邊、曠野、林緣等處土層深厚的地方,也可生長在石灰?guī)r地區(qū)的石縫或石礫中。金線吊烏龜?shù)膲K根為民間常用草藥,稱白藥、白藥子或白大藥,味苦性寒,有清熱解毒、消腫止痛之功效,常用于治療癰疽腫毒、腮腺炎、毒蛇咬傷等。塊根含多種生物堿[1],藥理學(xué)試驗(yàn)表明,它們具有多種臨床藥理活性,如增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié),促進(jìn)血管舒張,抗HIV-1,抗癌,抗過敏等[2-5]。金線吊烏龜還有殺蟲活性,平新亮[6-7]和劉艷華[8]等報道了其對白紋伊蚊、菜青蟲和蘿卜蚜的生物活性。目前為止,其抗菌活性未見報道。本文以農(nóng)業(yè)重要植物病原真菌為供試菌,對金線吊烏龜?shù)目咕钚约盎钚猿煞诌M(jìn)行了初步研究,以期為金線吊烏龜在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

金線吊烏龜(Stephania cepharantha Hayata)塊根采自桂北地區(qū)。

1.1.2 供試植物病原真菌

柿角斑病菌(Cercospora kaki Ell.et Ev.)、梨銹病菌(Gymnosporangium haraeanum Syd.)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae Cav.)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasolani Kühn)、玉米炭疽病菌[Colletotrichum graminicola(Ces.)Wilson.]、甘蔗鳳梨病菌[Thielaviopsisparadoxa(de Seynes)V.Hohnel]、西瓜枯萎病菌[Fusarium oxysporum f.sp.niveum(E.F.Smith)Syn.et Hans]、柑橘瘡痂病菌(Sphaceloma f awcettii Jenkins)。上述病原真菌通過從田間采集植物發(fā)病部位,在室內(nèi)用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)分離純化獲得。

1.1.3 供試對照藥劑

96%多菌靈原粉：江蘇新沂市經(jīng)緯化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取物的制備

參照陽振等[9]的方法,采用有機(jī)溶劑冷浸提取法對金線吊烏龜?shù)膲K根進(jìn)行提取。將采集的植物材料洗凈泥土和雜質(zhì),放在室內(nèi)通風(fēng)處晾干,再在60℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至發(fā)脆,用植物粉碎機(jī)粉碎,過40目篩。稱取一定量的植物干粉,放入1 000 mL三角瓶中,加入5倍量甲醇,在室溫下浸提(其間每隔12 h振蕩一次)24 h后傾出上層浸提液,再往三角瓶中加5倍量甲醇繼續(xù)浸提24 h,2次浸提液合并,抽濾,濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在水浴中減壓濃縮,蒸干溶劑,得膏狀植物粗提物,密封,放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 對病原真菌菌絲生長的抑制活性測定

參照陳年春[10]的菌絲生長速率法進(jìn)行測定。將供試菌接種在PDA平板培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng),備用。用V(丙酮)∶V(無菌水)=1∶1將樣品配成一定濃度的藥液備用。無菌條件下,吸取1 mL藥液(對照組用V(丙酮)∶V(無菌水)=1∶1代替)與熱熔的9 mL PDA培養(yǎng)基混勻,倒入直徑9 cm的培養(yǎng)皿中,制成厚薄均勻的帶藥培養(yǎng)基。用直徑為0.4 cm的打孔器在已擴(kuò)大培養(yǎng)的供試菌落邊緣切取菌餅,將菌餅接入帶藥培養(yǎng)基上,使有菌絲的一面朝下,每皿接3個菌餅,呈品字形分布,每個處理設(shè)3個重復(fù),置(27±1)℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用十字交叉法測量培養(yǎng)72 h(水稻紋枯病菌測量48 h)后的菌落直徑,根據(jù)下式求出抑菌率：

菌落直徑(cm)=測量直徑(cm)-0.4 cm;

抑菌率=(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑×100%。

測定有效中濃度時,用丙酮和水組成的混合溶劑配制5個以上系列濃度的藥液,測定各個濃度的抑菌率,用最小二乘法求出毒力回歸方程、有效中濃度EC50等。

1.2.3 對病原真菌孢子萌發(fā)的抑制活性測定

參照慕立義[11]的孢子萌發(fā)法。用少量丙酮將樣品溶解,再用無菌水配成一定濃度的藥液,備用。往事先培養(yǎng)好的供試菌中加適量無菌水,用涂布棒在菌落表面摩擦,使孢子脫落懸浮于無菌水中,用雙層紗布過濾后,配成孢子懸浮液(孢子密度為低倍鏡下每視野80個左右),備用。取9 cm直徑的培養(yǎng)皿,在皿蓋內(nèi)鋪上一層濾紙,并以水濕透,再將U型玻棒置于皿中央。將孢子懸浮液與藥液等量混合,用滴管加一滴混合液于干凈的載玻片表面(載玻片事先用0.25%火棉膠乙醚溶液處理過),然后將載玻片反放到U型玻棒上,使液滴向下,形成“懸滴”。將皿底扣上,置于(27±1)℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理設(shè)3個重復(fù)。將處理過的孢子培養(yǎng)一定時間后,檢查并記錄孢子萌發(fā)的情況(每個處理在低倍鏡下隨機(jī)檢查200個孢子),按下式計算孢子萌發(fā)抑制率。

萌發(fā)率=孢子萌發(fā)數(shù)/檢查孢子總數(shù)×100%;

1.2.4 活性物質(zhì)的初步分離

按照以下程序(圖 1)對活性成分進(jìn)行初步分離,將塊根提取物分離成3部分,即非生物堿、氯仿層生物堿和正丁醇層生物堿。

圖1 金線吊烏龜抑制病原菌活性成分的初步分離程序

2 結(jié)果與分析

2.1 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性

采用菌絲生長速率法測定了金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,金線吊烏龜提取物對梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌有很高的抑制活性,質(zhì)量濃度為10 g/L時,抑菌率分別為97.74%、100.00%、94.51%和84.40%,對柿角斑病菌的活性較低,抑菌率只有67.59%。廣譜殺菌劑多菌靈在質(zhì)量濃度為1 g/L時,對柿角斑病菌、水稻紋枯病菌以及玉米炭疽病菌的抑菌率均為100.00%,但對梨銹病菌和稻瘟病菌的抑制活性低,抑菌率分別只有10.27%和23.94%。

表1 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性

2.2 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的毒力

為進(jìn)一步明確金線吊烏龜塊根的抗菌效果,測定了其甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的毒力,結(jié)果見表2。由表2可知,金線吊烏龜塊根甲醇提取物對柿角斑病菌、梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌的EC50分別為1.349 1、0.587 9、0.312 2、0.280 7 g/L 和0.835 3 g/L;對照藥劑多菌靈對柿角斑病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌的EC50分別為8.717 1×10-5、7.544 7×10-4g/L和 8.738 4×10-5g/L,對3種病原真菌的毒力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于金線吊烏龜。

表2 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對5種植物病原真菌菌絲生長的毒力

2.3 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對4種植物病原真菌孢子萌發(fā)的抑制活性

在實(shí)驗(yàn)室條件下,采用孢子萌發(fā)法測定了金線吊烏龜塊根甲醇提取物對4種植物病原真菌孢子萌發(fā)的抑制活性,結(jié)果見表3。在質(zhì)量濃度為10 g/L時,金線吊烏龜甲醇提取物能很好地抑制甘蔗鳳梨病菌孢子、柑橘瘡痂病菌孢子和梨銹病菌孢子的萌發(fā),對以上3種病原真菌孢子萌發(fā)的抑制率分別為91.80%、97.00%和100.00%。金線吊烏龜對西瓜枯萎病菌孢子萌發(fā)的抑制效果比較差,抑制率僅為20.63%。

表3 金線吊烏龜塊根甲醇提取物對4種病原真菌孢子萌發(fā)的抑制活性1)

2.4 金線吊烏龜塊根甲醇提取物粗分各部分的抗菌活性

對金線吊烏龜塊根甲醇提取物進(jìn)行了初步分離,將其分成非生物堿、氯仿層生物堿和正丁醇層生物堿3部分,各部分的百分含量分別為14.12%、13.53%和11.76%。

采用菌絲生長速率法測定了非生物堿、氯仿層生物堿和正丁醇層生物堿3部分的抗菌活性,結(jié)果見表4。當(dāng)處理濃度為2 g/L時,氯仿層生物堿對柿角斑病菌、梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌的抑菌率分別為51.53%、85.65%、72.93%、75.22%和61.97%,抑菌率均高于正丁醇層生物堿和非生物堿部分,說明金線吊烏龜?shù)目咕钚猿煞种饕锹确聦由飰A。

表4 金線吊烏龜粗分各部分對5種植物病原真菌菌絲生長的抑制活性1)

3 結(jié)論與討論

經(jīng)活性測定發(fā)現(xiàn),金線吊烏龜塊根甲醇提取物對梨銹病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌和玉米炭疽病菌這4種植物病原真菌菌絲生長具有顯著的抑制活性,但對柿角斑病菌的活性較低;同時,金線吊烏龜提取物對甘蔗鳳梨病菌孢子、柑橘瘡痂病菌孢子和梨銹病菌孢子的萌發(fā)具有顯著的抑制效果。由此可見,金線吊烏龜不僅具有抗菌廣譜性,且可能具有多種抗菌作用方式。金線吊烏龜?shù)膲K根含多種生物堿,經(jīng)初步分離,并結(jié)合生物活性追蹤,發(fā)現(xiàn)金線吊烏龜?shù)目咕钚猿煞种饕谴嬖谟诼确聦拥纳飰A,可采用色譜、光譜技術(shù)對其中的活性化合物做進(jìn)一步的分離、純化和鑒定,為新農(nóng)藥的創(chuàng)制提供先導(dǎo)化合物,這對新農(nóng)藥的創(chuàng)制具有重要意義。以前的化學(xué)殺菌劑因其作用位點(diǎn)單一而使病原菌容易產(chǎn)生抗性[12],而金線吊烏龜有可能具有多種抗菌作用方式,因此進(jìn)一步探究其作用機(jī)理可為開發(fā)具有多作用位點(diǎn)的植物源殺菌劑提供重要的理論依據(jù),豐富植物源天然產(chǎn)物農(nóng)藥的理論基礎(chǔ)。需要指出的是,試驗(yàn)結(jié)果顯示金線吊烏龜?shù)拇痔嵛锟咕钚赃h(yuǎn)遠(yuǎn)低于化學(xué)農(nóng)藥多菌靈,這也是植物農(nóng)藥難以替代化學(xué)農(nóng)藥的重要原因。通過對活性成分的結(jié)構(gòu)改造,有可能提高活性。

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