多菌靈/戊唑醇復(fù)配對小麥赤霉病菌抗藥性菌株的活性增效作用

畢秋艷, 馬志強(qiáng), 張小風(fēng), 王文橋, 韓秀英, 陳 丹

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所,省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心,保定 071000;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院農(nóng)藥系,保定 071001)

由禾谷鐮孢菌(Fusarium graminearum Schwabe)引起的小麥赤霉病,一直是我國江淮流域、西南冬麥區(qū)及東北春麥區(qū)最重要的小麥病害之一。抽穗揚(yáng)花期噴施多菌靈等苯并咪唑類殺菌劑是我國自20世紀(jì)70年代中期以來防治小麥赤霉病的關(guān)鍵措施之一。自1992年周明國等[1]在浙江海寧市小麥病穗上檢測到世界首例禾谷鐮孢菌抗藥性菌株以來,在浙、蘇、滬、鄂等地進(jìn)行了連年抗藥性監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)抗藥性病原菌群體比例迅速上升,在浙江等地已成為致病優(yōu)勢小種;同時(shí),抗藥性病原菌分布范圍不斷擴(kuò)大,已從最初的浙江蔓延到上海和江蘇大部分地區(qū)。如何延緩和解決抗藥性問題,成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。

隨著農(nóng)業(yè)的全面發(fā)展,植物病害的危害性與日俱增。由于一些化學(xué)藥劑復(fù)配后能產(chǎn)生增效作用,因此殺菌劑的復(fù)配效益日益得到重視。它不但可以減少病害造成的產(chǎn)量損失,增加農(nóng)業(yè)收入,更重要的是能使病害得到有效控制,同時(shí)還能減少成本投入及節(jié)省勞力。因此,科學(xué)復(fù)配殺菌劑具有現(xiàn)實(shí)意義,一可以減少病原菌產(chǎn)生抗藥性的風(fēng)險(xiǎn)[2],二可以達(dá)到比殺菌劑單劑更好的防治效果,三可以大大降低開發(fā)新型殺菌劑的難度。劉學(xué)敏[3]等提出增效作用機(jī)制可能是各個(gè)特殊效果的綜合,其中降低病原菌的侵入、在目標(biāo)位點(diǎn)增加藥劑組分的濃度可能是主要原因,但殺菌劑復(fù)配增效機(jī)理至今尚未解釋清楚。復(fù)配殺菌劑作用機(jī)理應(yīng)著眼于內(nèi)在本質(zhì)的研究[4-5]。本課題對多菌靈、戊唑醇復(fù)配增效作用從不同方面進(jìn)行初探,為解決鐮刀菌對多菌靈抗藥性問題以及更加合理地復(fù)配殺菌劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

室內(nèi)試驗(yàn)于2009年在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所中心試驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

采用禾谷鐮孢菌(F.graminearum)多菌靈抗藥菌株分離得到的單孢進(jìn)行試驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)室采自南京的抗藥性菌株Nj-1-1在3.2 μ g/mL的多菌靈處理下仍可以生長,采自河北的敏感菌株 Hb-5-2在0.052 μ g/mL的多菌靈處理下停止生長。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別采用菌絲生長速率法、孢子萌發(fā)速率法、測定細(xì)胞膜透性、測定菌體內(nèi)麥角甾醇含量的方法進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 藥品規(guī)格

98%多菌靈(carbendazim)原藥(沈陽化工研究院提供)用0.1 mol/mL鹽酸溶解后,用重蒸水配成6.4 μ g/mL母液;95.34%戊唑醇(tebuconazole)原藥(香港九龍農(nóng)藥廠提供)用適量丙酮溶解后,用重蒸水配成6.4 μ g/mL母液。

1.3.3 增效作用測定

采用菌絲生長速率法[6]。分別將多菌靈和戊唑醇母液用無菌水稀釋成濃度為0、0.10、0.20、0.40、0.80 、1.60、3.20、6.40 μ g/mL 的藥液,按多菌靈與戊唑醇體積比 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4 、3∶4、4∶3、4∶1 、3∶1、2∶1的比例取相同濃度的兩種藥液混合均勻。將配好的藥液與培養(yǎng)基按體積比1：9的比例進(jìn)行混合,制成PDA平板,接菌,用于測定藥劑對抗性菌株菌絲生長的抑制作用。每次處理重復(fù)4次,試驗(yàn)重復(fù)2次。置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d(均設(shè)置空白、等濃度鹽酸及丙酮對照)。根據(jù)各濃度處理下藥劑對菌絲生長的抑制率,求出多菌靈、戊唑醇以及多菌靈/戊唑醇復(fù)配組合在PDA培養(yǎng)基上抑制菌絲生長的有效中濃度EC50,計(jì)算復(fù)配組合的增效強(qiáng)度SR,篩選出最佳組合用于以下試驗(yàn)。

1.3.4 多菌靈/戊唑醇對小麥赤霉病菌孢子萌發(fā)速率的影響

將供試小麥赤霉病菌不同菌株分別接于PDA平板上,25℃下黑暗培養(yǎng)7 d,制成d=5 mm菌餅,分別接入羧甲基纖維素鉀培養(yǎng)液中,于25℃恒溫培養(yǎng)箱中振蕩(230 r/min)培養(yǎng)10 d后,過濾將孢子與菌絲分開[7]。然后將PDA及人工合成培養(yǎng)基稀釋10倍加1%瓊脂固定,在此基礎(chǔ)上分生孢子萌發(fā)率可達(dá)90%以上。利用WHO推薦的區(qū)分劑量法[8],將多菌靈、戊唑醇單劑配置成濃度均為1.6 μ g/mL,并按此濃度配置成1.3.3得到的多菌靈/戊唑醇最佳復(fù)配組合的溶液。培養(yǎng)基融化時(shí)將藥液與培養(yǎng)基1∶9混合,用玻璃棒涂于載玻片上制成毒膜,然后用接種器分別接種上面培養(yǎng)的不同抗性菌株的分生孢子,并檢查孢子密度,至100倍鏡下每視野約20個(gè)孢子時(shí)止。將此載玻片平架于塑料盒中,盒底部注水 ,蓋上蓋后于 25 ℃左右培養(yǎng) ,2、4、6、8、10 、12 h 后分別觀察敏感菌株與抗性菌株的孢子萌發(fā)情況。試驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3.5 多菌靈/戊唑醇對抗性菌株細(xì)胞膜透性影響

利用WHO推薦的區(qū)分劑量法[8],用重蒸水分別將多菌靈和戊唑醇母液稀釋成1.6 μ g/mL,再將兩者以相同濃度配置成最佳復(fù)配組合溶液60 mL,分別于100 mL三角瓶中測定各溶液的電導(dǎo)率,重復(fù)4次。

將1.3.4分離得到的新鮮菌絲用重蒸水沖洗,真空抽濾后稱取 1.0 g(未經(jīng)烘干的菌絲)放入100 mL三角瓶中。分別用PS將多菌靈和戊唑醇母液稀釋成終濃度為1.6 μ g/mL的濃液,以及兩者以相同濃度配置成4∶3的復(fù)配溶液,加入三角瓶中,使得100 mL三角瓶中溶液體積分別為60 mL。于25℃的恒溫條件下保持振蕩(230 r/min),分別測定0(即 剛放 入菌絲)、5 、10 、15 、30 、60 、90 、120、180、240、300、360、420、480、540 min 及死處理(煮沸30 min)時(shí)的電導(dǎo)率[9]。每濃度重復(fù)4次,以重蒸水為對照。按(1)式計(jì)算相對滲率,再根據(jù)相對滲率比較細(xì)胞膜的透性。

Ct：某一時(shí)刻的電導(dǎo)率;C0：最初(0 min)時(shí)的電導(dǎo)率;C死處理：死處理后的電導(dǎo)率。

1.3.6 多菌靈/戊唑醇對抗藥菌株菌絲體麥角甾醇合成的影響[10]

將裝有50 mL羧甲基纖維素培養(yǎng)液的三角瓶在高溫下濕熱滅菌(121℃,30 min),在無菌條件下配置0.0～1.6 μ g/mL多菌靈、戊唑醇及 V(多菌靈)∶V(戊唑醇)=4∶3復(fù)配組合的羧甲基纖維素培養(yǎng)液,接種定量的小麥赤霉病菌菌絲塊(菌絲塊已在25℃下黑暗培養(yǎng)7 d),振蕩培養(yǎng)(230 r/min,25℃,7 d)。取出培養(yǎng)的菌絲體,脫水后保存?zhèn)溆谩?/p>

取經(jīng)多菌靈、戊唑醇及兩者4∶3復(fù)配組合不同處理后的菌絲體0.5 g,加甲醇和氯仿混合液(2∶1)勻漿,定容至10 mL,25℃靜置0.5 h,分別加水、氯仿和含有0.5 mol/L的磷酸緩沖液(pH7.4)各10 mL,分層,使氯仿相在水浴上蒸干。加入含有1.4 mol/L KOH的甲醇和乙醇(4∶1)混合液20 mL,60℃皂化1 h,然后再加水、石油醚(沸程60～90 ℃)各 10 mL,分層后取石油醚蒸干,用乙醇洗下并定容至10 mL,在紫外分光光度計(jì)上測得各處理的A280nm值,據(jù)此求得菌絲麥角甾醇含量的相對變化。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用DPS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)算回歸方程、EC50及相關(guān)系數(shù)。根據(jù)Wadelly公式[8-9]推算增效系數(shù)SR。

2 結(jié)果與分析

2.1 多菌靈、戊唑醇以及兩者復(fù)配組合毒力增效結(jié)果

多菌靈與戊唑醇4∶3復(fù)配組合對多菌靈抗性菌株增效系數(shù)SR＞1.5,具有明顯增效作用,對抗性菌株的增效比為1.833 0。(鹽酸對照、丙酮對照與空白對照生長基本一致,下面試驗(yàn)結(jié)果不受溶劑影響,不再重復(fù)說明對照)。

表1 多菌靈、戊唑醇及兩者復(fù)配組合對小麥赤霉病菌抗性菌株菌絲生長的抑制作用

2.2 多菌靈/戊唑醇對小麥赤霉病菌孢子萌發(fā)速率的影響

藥劑處理后,抗性菌株Nj-1-1的孢子在12 h后均可萌發(fā),且與對照的萌發(fā)率無明顯差異。V(多菌靈)∶V(戊唑醇)=4∶3處理后孢子萌發(fā)速率較對照、多菌靈、戊唑醇有所減慢,但萌發(fā)開始時(shí)間早于敏感菌株Hb-5-2,幾乎與對照和多菌靈、戊唑醇相同,8 h后萌發(fā)速率與戊唑醇幾乎相同。說明4∶3復(fù)配組合可以減慢孢子的萌發(fā)速率,但不能完全抑制孢子萌發(fā),其對孢子萌發(fā)的抑制率明顯高于單劑。

圖1 多菌靈、戊唑醇單用及混用對小麥赤霉病菌抗性菌株孢子萌發(fā)的影響

2.3 多菌靈/戊唑醇對抗性菌株細(xì)胞膜透性的影響

測定結(jié)果(表 2)顯示,0.0、1.6 μ g/mL 等不同濃度的不同藥劑溶液的電導(dǎo)率沒有顯著差異。后面試驗(yàn)中,加入不同抗性的菌絲體后,不同藥劑的不同濃度溶液之間的電導(dǎo)率差異及其相對滲率的變化,可歸因于不同菌株之間細(xì)胞膜透性的差異及其菌株與藥劑相互作用所引起的細(xì)胞膜透性的改變。

表2 不同藥劑不同濃度的電導(dǎo)率比較(n=4)1)

單劑、混劑和對照變化規(guī)律相同說明藥劑進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后均能使細(xì)胞膜透性發(fā)生改變,但藥劑作用特點(diǎn)不同,對細(xì)胞膜透性的影響程度不同。

30 min內(nèi)滲透率上升表明在藥劑的作用下真菌細(xì)胞內(nèi)含物外滲,將影響細(xì)胞的正常生長;200 min滲透率下降,可能是由于溶液離子與內(nèi)含物發(fā)生一定反應(yīng)后使內(nèi)含物停止外滲,外界反應(yīng)產(chǎn)物對細(xì)胞膜產(chǎn)生一定壓力破壞造成。

多菌靈/戊唑醇(4∶3)處理抗性菌株后,在240 min處相對滲率上升,說明該復(fù)配組合使細(xì)胞內(nèi)含物在此時(shí)間過后一直外滲,加速了細(xì)胞萎縮死亡速率,可能與其增效作用有關(guān)。

圖2 多菌靈、戊唑醇單用及混用在1.6 μ g/mL下對抗性菌株相對滲率的影響

2.4 多菌靈/戊唑醇對小麥赤霉病菌抗藥性菌株麥角甾醇合成的影響

多菌靈為脫氫酶抑制劑,戊唑醇為甾醇抑制劑。多菌靈與戊唑醇(4∶3)復(fù)配組合在同等濃度下對麥角甾醇的抑制顯著高于單劑,比多菌靈、戊唑醇高6～10倍。多菌靈與戊唑醇的復(fù)配增效作用對小麥赤霉病菌抗性菌株與敏感菌株的麥角甾醇合成均有嚴(yán)重影響。但是,脫氫酶與甾醇合成是如何互相影響的有待于進(jìn)一步研究。

表3 多菌靈、戊唑醇以及混用(4∶3)對小麥赤霉病菌抗藥菌株麥角甾醇生物合成的影響

3 討論

在目前抗病品種缺乏的情況下[11],選擇適當(dāng)藥劑并采用合適的施藥方法是防治小麥赤霉病的重要措施。多菌靈用于小麥赤霉病的防治已有20多年,監(jiān)測已發(fā)現(xiàn)存在抗藥性病原菌群體。本研究表明,多菌靈與戊唑醇4∶3的復(fù)配組合離體條件下對小麥赤霉病菌抗性菌株與敏感菌株的增效系數(shù)(SR)均大于1.5,表現(xiàn)為增效作用。具體表現(xiàn)在減慢抗性菌株的孢子萌發(fā)速率、影響菌株細(xì)胞膜的滲透性、使菌株細(xì)胞內(nèi)含物麥角甾醇的含量降低等。田間藥效尚需進(jìn)一步明確。

不同作用機(jī)制藥劑的復(fù)配研究具有重要意義。苯并咪唑類殺菌劑多菌靈具有廣譜高效、內(nèi)吸傳導(dǎo)的作用特點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于防治多種病害,但由于其作用位點(diǎn)單一,病原菌極易產(chǎn)生抗藥性。三唑類殺菌劑的主要作用機(jī)制是抑制細(xì)胞的麥角甾醇的生物合成,具有廣譜、保護(hù)、治療及內(nèi)吸作用,由于其作用位點(diǎn)多,病原菌抗藥性的產(chǎn)生較緩慢。兩者混配使之增加了作用位點(diǎn)和作用途徑,一段時(shí)期內(nèi)病原菌的簡單變異不足于適應(yīng)全部作用位點(diǎn)。

隨著新藥劑的不斷問世和用藥技術(shù)的發(fā)展,復(fù)配殺菌劑有了充分發(fā)展的空間。應(yīng)用復(fù)配殺菌劑防治植物病害在生產(chǎn)中早已大量出現(xiàn)。但植物病害防治是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)。藥劑在植物體內(nèi)傳導(dǎo)后,在不同的時(shí)間段會產(chǎn)生不同的結(jié)果[12],無論對植物體、菌體,還是藥劑本身,甚至周圍環(huán)境都會產(chǎn)生不同的影響。殺菌劑復(fù)配機(jī)理,特別是增效藥劑組合及其不同作用位點(diǎn)的互作,有待于深入研究,以便為克服抗藥性以及合理復(fù)配殺菌劑奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

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