溫度對(duì)綠僵菌LA菌株孢子萌發(fā)、酶活力及毒力的影響

岳 梅, 雷仲仁, 孟 濤, 王兆勇, 姚君明

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

綠僵菌是蟲(chóng)生真菌主要類群之一,寄主范圍廣,能寄生8目30科約200種昆蟲(chóng)、螨類及線蟲(chóng)[1],是當(dāng)今蟲(chóng)生真菌研究的主要對(duì)象之一。影響綠僵菌生長(zhǎng)和生理代謝的因素較多,其中溫度是最重要的因素之一[2],綠僵菌入侵昆蟲(chóng)的每一步都與溫度緊密相關(guān)。

東亞飛蝗是我國(guó)歷史上的重要害蟲(chóng),其為害植物以禾本科、莎草科為主,至今仍嚴(yán)重威脅我國(guó)的糧食生產(chǎn)[3]。近年來(lái),全球性氣候變化為蝗災(zāi)的發(fā)生創(chuàng)造了有利條件,加重了蝗災(zāi)的發(fā)生。綠僵菌防治蝗蟲(chóng)具有很好的效果,但是近些年的研究表明,蝗蟲(chóng)具有較強(qiáng)的體溫調(diào)節(jié)行為,當(dāng)體溫升高至一定程度便能有效地降低綠僵菌的致病力,因此綠僵菌耐受高溫的能力便成為影響病原與寄主互作關(guān)系的重要因素。作者即對(duì)綠僵菌LA菌株在不同溫度下的萌發(fā)率、胞外蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活力以及對(duì)東亞飛蝗的毒力進(jìn)行了研究,并與東亞飛蝗室內(nèi)接受輻射熱可保持的適宜體溫結(jié)合,測(cè)定了不同高溫處理下綠僵菌孢子萌發(fā)情況,以期明確溫度對(duì)綠僵菌與蝗蟲(chóng)互作的影響。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)與菌株

本試驗(yàn)所用東亞飛蝗系實(shí)驗(yàn)室多年續(xù)代飼養(yǎng),于網(wǎng)室內(nèi)每天用新鮮玉米葉片和麥麩飼喂的健康群體。

綠僵菌LA菌株,最早分離自天津大港的東亞飛蝗,本實(shí)驗(yàn)室續(xù)代保存。

1.2 溫度對(duì)LA菌株孢子萌發(fā)的影響

采用微室萌發(fā)法[4]測(cè)定孢子萌發(fā)率,取載玻片置于保濕的培養(yǎng)皿中,分別滴入孢子萌發(fā)液(1%蛋白胨、1%葡萄糖和0.05%吐溫80)和孢子液各一滴混勻,封口膜密封培養(yǎng)皿,制成萌發(fā)微室。萌發(fā)率為選定視野內(nèi)萌發(fā)孢子數(shù)與總孢子數(shù)的比值,每次計(jì)數(shù)5個(gè)視野求平均值。

1.2.1 不同溫度下孢子萌發(fā)速率

將上述培養(yǎng)皿分別置于 20、25、30、35 ℃和40℃人工氣候箱(RXZ智能型,寧波江南儀器廠)內(nèi)培養(yǎng),設(shè)置溫度的誤差為1℃,箱內(nèi)濕度保持在40%～50%。4h后開(kāi)始計(jì)數(shù)萌發(fā)率,每隔4h計(jì)數(shù)1次,記錄24h。重復(fù)3次求平均數(shù)。

1.2.2 高溫下孢子萌發(fā)速率測(cè)定

根據(jù)1.2.1部分的結(jié)果,設(shè)定35～40℃之間每隔1℃為一溫度梯度,即分別將待測(cè)孢子置于36、37、38℃和39℃,培養(yǎng)8h后開(kāi)始測(cè)定萌發(fā)率,每隔8h計(jì)數(shù)1次,記錄48h,測(cè)定孢子可萌發(fā)的最高溫度。重復(fù)3次求平均數(shù)。

1.2.3 不同高溫處理對(duì)孢子萌發(fā)速率的影響

用無(wú)菌水配制孢子懸浮液,倒入2mL離心管中,分別置于42、45 ℃和 48 ℃水浴中,處理 3、6h和9h,取出后用微室培養(yǎng)法置于30℃下培養(yǎng),4h后計(jì)數(shù)萌發(fā)率,每隔4h計(jì)數(shù)1次,記錄 24h。重復(fù)3次求平均數(shù)。

1.3 溫度對(duì)LA菌株酶活力的影響

1.3.1 培養(yǎng)基

SDA 培養(yǎng)基 ：葡萄糖40g/L,蛋白胨10g/L,酵母浸膏 10g/L。蛋白酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基：1%明膠,K2HPO4,NaCl和MgSO4?7H2O 各 0.3g/L。各組分溶入pH7.0的0.02mol/L磷酸緩沖液。幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基：蛋白胨0.5%,KH2PO4,KCl,MgSO4?7H2O各0.05%,ZnSO4?7H2O0.1%,脫礦幾丁質(zhì)1%,pH6.0。

膠體幾丁質(zhì)的制備：稱取幾丁質(zhì)25g,85%磷酸250mL,30℃反應(yīng)1.5d,加蒸餾水待膠體沉淀后,反復(fù)水洗至中性,用 0.02mol/L磷酸緩沖液(pH6.0)調(diào)整終濃度至2%。

1.3.2 不同培養(yǎng)時(shí)間胞外蛋白酶活力的測(cè)定

將少量LA菌粉加入胞外蛋白酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,30℃,130r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng),分別提取第3天、第4天、第5天、第6天、第7天的酶液,將2%酪蛋白1mL加入1mL酶液中,40℃反應(yīng)10min,加2mL0.4mol/L三氯乙酸溶液中止反應(yīng),室溫放置待沉淀完全。用Folin-酚試劑檢測(cè),以每分鐘催化分解1μg酪蛋白的酶量為一個(gè)活性單位(U/mL)。重復(fù)3次求平均數(shù)。

1.3.3 溫度對(duì)胞外蛋白酶活力的影響

1.3.4 不同培養(yǎng)時(shí)間幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定

將少量菌粉加入到幾丁質(zhì)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中30℃,130r/min旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng),分別提取第3天、第4天、第5天、第6天、第 7天的酶液,在1mL膠體幾丁質(zhì)中,分別加入酶液0.5mL,50℃反應(yīng)1h,用DNS法測(cè)定產(chǎn)生的還原糖,以每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1μL的NAG所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。重復(fù)3次求平均數(shù)。

1.3.5 溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

取1.3.4中培養(yǎng)第5天的酶液,在1mL膠體幾丁質(zhì)中 ,加入酶液 0.5mL,20 、25、30、35、40、45、50、55℃下反應(yīng)1h,用DNS法測(cè)定產(chǎn)生的還原糖。以每分鐘產(chǎn)生相當(dāng)于1μg的NAG所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位(U/mL)。重復(fù)3次求平均數(shù)。

1.4 溫度對(duì)LA菌株毒力的影響

配制孢子濃度為2.6×107個(gè)/mL,每頭蝗蟲(chóng)接種0.5μL,設(shè)定人工氣候箱溫度分別為 20、25、30、35、40℃5個(gè)溫度,選用5齡東亞飛蝗若蟲(chóng),每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)并設(shè)對(duì)照,每個(gè)重復(fù)選用20頭試蟲(chóng),每日調(diào)查蝗蟲(chóng)死亡情況并將死蟲(chóng)保濕培養(yǎng),記錄15d,計(jì)算 LT50和LT90。

1.5 數(shù)據(jù)處理分析

應(yīng)用DPS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析并計(jì)算LT50、LT90。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度下孢子萌發(fā)速率

采用微室萌發(fā)法測(cè)定了不同溫度下LA菌株分生孢子萌發(fā)情況,結(jié)果如圖1,LA孢子在30℃下4h即有10.2%孢子萌發(fā),8h萌發(fā)率達(dá)到72.3%,35℃下4h也有5.1%孢子萌發(fā),總體而言,前12h孢子萌發(fā)速率依次為30℃＞35℃＞25℃＞20℃＞40℃,LA孢子在20～35℃均可萌發(fā),24h內(nèi)均能達(dá)到90%以上的萌發(fā)率,而40℃下24h內(nèi)孢子無(wú)萌發(fā)現(xiàn)象。

圖1 溫度對(duì)LA分生孢子萌發(fā)的影響

2.2 高溫下孢子萌發(fā)速率

LA分生孢子在36～39℃下培養(yǎng)48h內(nèi)孢子萌發(fā)情況如圖2所示。溫度每升高1℃,孢子萌發(fā)率均有較大程度降低,36℃下48h孢子萌發(fā)率達(dá)到80.2%,而39℃下僅為10.1%,此溫度范圍屬LA萌發(fā)的不適合溫度,高于39℃的環(huán)境溫度下分生孢子基本不能正常萌發(fā)。

互聯(lián)網(wǎng)與通信技術(shù)的發(fā)展打破了傳統(tǒng)學(xué)習(xí)的時(shí)空約束，改變了學(xué)生的學(xué)習(xí)行為，使學(xué)習(xí)更具有靈活性和主動(dòng)性，網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)的即時(shí)性也最大限度的幫助成人學(xué)生克服工學(xué)矛盾， 但網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)改變成人學(xué)習(xí)行為的同時(shí)也產(chǎn)生了一些消極的影響。在未來(lái)成人教育體系中，學(xué)生不僅僅是傳統(tǒng)課堂學(xué)習(xí)的“補(bǔ)充型”學(xué)習(xí)，而且是終身學(xué)習(xí)的踐行者，而網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)給成人學(xué)生的終身學(xué)習(xí)提供了條件。成人教育的研究者和工作者，應(yīng)更客觀地看待互聯(lián)網(wǎng)在網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)中的作用和學(xué)生具體學(xué)習(xí)行為的嬗變，努力揚(yáng)長(zhǎng)避短，使成人學(xué)生在網(wǎng)絡(luò)學(xué)習(xí)中朝著更有益的方向發(fā)展。

圖2 高溫下LA分生孢子的萌發(fā)情況

2.3 不同高溫處理對(duì)孢子萌發(fā)速率的影響

不同時(shí)間高溫處理對(duì)孢子萌發(fā)率的影響見(jiàn)表1,由表可以看出,隨著處理溫度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng),孢子萌發(fā)率均有不同程度的降低,48℃下對(duì)孢子萌發(fā)影響最大,處理9h后30℃下微室培養(yǎng)24h萌發(fā)率僅為10%。42℃和45℃高溫處理轉(zhuǎn)至30℃下培養(yǎng)24h,孢子萌發(fā)率均在85%以上,試驗(yàn)2.1中未經(jīng)高溫處理30℃下8h萌發(fā)率達(dá)70%,而經(jīng)高溫處理后8h萌發(fā)率最高僅為11.7%。整體而言,在本試驗(yàn)所處理的時(shí)間范圍內(nèi),48℃下分生孢子受高溫影響,轉(zhuǎn)至最適培養(yǎng)溫度下也無(wú)法正常萌發(fā);42℃和45℃處理一定時(shí)間,延緩了孢子的萌發(fā),但不能最終影響孢子萌發(fā)率。

2.4 LA菌株胞外蛋白酶活力測(cè)定

2.4.1 不同培養(yǎng)時(shí)間胞外蛋白酶活力測(cè)定

培養(yǎng)第3、4、5、6、7天所得胞外蛋白酶活力曲線如圖3所示,隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加,酶活力逐漸升高,至第6天達(dá)到最高,活力值為31.37U/mL。

表1 不同高溫處理時(shí)間對(duì)LA孢子萌發(fā)率的影響1)

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間LA胞外蛋白酶活力

2.4.2 溫度對(duì)胞外蛋白酶活力的影響

取培養(yǎng)第6天的蛋白酶液,在不同溫度下反應(yīng)所得的酶活力結(jié)果見(jiàn)圖4,由圖可以看出,37℃左右蛋白酶活力最高,20℃下蛋白酶活力最低,活力值為20.62U/mL,酶活力是一個(gè)先增加后降低的過(guò)程。

圖4 不同溫度下LA胞外蛋白酶活力

2.5 LA菌株幾丁質(zhì)酶活力測(cè)定

2.5.1 不同培養(yǎng)時(shí)間幾丁質(zhì)酶活力的測(cè)定

培養(yǎng)第 3、4、5、6、7天所得幾丁質(zhì)酶活力曲線如圖5所示,酶活力至第 5天達(dá)到最高,活力值為34.62U/mL,之后繼續(xù)培養(yǎng)呈下降趨勢(shì)。

圖5 不同培養(yǎng)時(shí)間LA幾丁質(zhì)酶活力

2.5.2 溫度對(duì)幾丁質(zhì)酶活力的影響

取培養(yǎng)第5天的幾丁質(zhì)酶液,在不同溫度下反應(yīng)所得的酶活力結(jié)果見(jiàn)圖6,由圖可以看出,幾丁質(zhì)酶活力在50℃下最高,活力值為 34.62U/mL,20℃下最低,活力值為23.53U/mL,幾丁質(zhì)酶活力是一個(gè)先增加后降低的過(guò)程。

圖6 不同溫度下LA幾丁質(zhì)酶活力

2.6 溫度對(duì)LA菌株毒力的影響

不同溫度下LA對(duì)東亞飛蝗5齡若蟲(chóng)的毒力見(jiàn)表2,由此表可以看出30℃下LT50和 LT90最低,20℃和40℃下致死時(shí)間較長(zhǎng),25℃和35℃下致死時(shí)間居中,30℃為 LA對(duì)東亞飛蝗致病力最強(qiáng)的溫度。

表2 不同溫度下LA對(duì)東亞飛蝗致死時(shí)間1)

試蟲(chóng)一般從第3天開(kāi)始大量死亡,不同溫度下試蟲(chóng)的累計(jì)死亡率見(jiàn)圖7,不同溫度下LA的毒力差異可從死亡曲線的延伸角度和高度直觀看出,30℃下第8天試蟲(chóng)死亡率已達(dá)100%,而40℃下至15d仍有部分試蟲(chóng)未死亡。

圖7 不同溫度下接種LA東亞飛蝗的累計(jì)死亡率

3 討論

在適宜的溫度范圍內(nèi),綠僵菌LA孢子萌發(fā)速率快,致病力強(qiáng),相反,如果環(huán)境溫度過(guò)高或過(guò)低,超出了其適合生長(zhǎng)侵染的溫度,致病力便會(huì)大大降低。

本研究結(jié)果顯示,30℃是LA孢子萌發(fā)的最適溫度,在此溫度下菌株LA對(duì)蝗蟲(chóng)的致死速率最快,38℃下培養(yǎng)48h,孢子的萌發(fā)率只有10%左右,40℃下培養(yǎng)孢子的萌發(fā)率趨近于0,說(shuō)明該菌株孢子萌發(fā)受溫度影響較大?；认x(chóng)適宜發(fā)育的溫度在25～40℃之間,最適宜溫度范圍為28～34℃[5],在有體溫調(diào)節(jié)或太陽(yáng)輻射條件下,蟲(chóng)體溫度可以達(dá)到42℃,此溫度限制了LA孢子的萌發(fā),這也是在田間應(yīng)用綠僵菌治蝗后如遇晴天高溫,其防效不好的主要原因。

綠僵菌的致死溫度(10min內(nèi)殺死孢子的速度)介于49～60℃之間[6],菌絲體生長(zhǎng)的上限溫度約在37～40℃[7-8]。經(jīng)高溫處理的孢子,移至適合溫度下培養(yǎng),萌發(fā)速率和萌發(fā)率均有所降低,說(shuō)明孢子萌發(fā)及存活情況與所達(dá)到的高溫程度和該溫度處理的時(shí)間有關(guān)。本試驗(yàn)最高處理溫度為48℃,該溫度下導(dǎo)致絕大部分孢子失去萌發(fā)能力,恢復(fù)至30℃培養(yǎng)萌發(fā)率24h僅為20%左右。

馮明光[9]研究認(rèn)為胞外蛋白酶活性可作為球孢白僵菌大量菌株初篩的參考性毒力指標(biāo),但應(yīng)謹(jǐn)慎使用,不能完全取代常規(guī)的毒力測(cè)定。林海萍等[10]對(duì)15個(gè)球孢白僵菌菌株進(jìn)行了酶活力和毒力測(cè)定,認(rèn)為這些菌株的蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、脂肪酶活性與對(duì)松墨天牛毒力間呈極顯著正相關(guān)。本試驗(yàn)選用LA菌株蛋白酶和幾丁質(zhì)酶活力最高的培養(yǎng)時(shí)間,進(jìn)行了不同溫度下的酶活力測(cè)定,結(jié)合對(duì)應(yīng)溫度下對(duì)東亞飛蝗毒力的測(cè)定,結(jié)果表明,在菌株的極限高溫和極限低溫時(shí)菌株的胞外蛋白酶產(chǎn)量明顯減少,其相應(yīng)的LT50也較大;而在菌株的最適生長(zhǎng)溫度時(shí),其相應(yīng)的LT50值較小,說(shuō)明胞外蛋白酶產(chǎn)生水平與毒力之間存在一定的協(xié)同性,即產(chǎn)酶水平越高,菌株對(duì)東亞飛蝗的毒力就越大,因此可以認(rèn)為綠僵菌的胞外蛋白酶合成能力是其毒力的決定因素之一。Kucera[11]和St.Leger等[12]也指出綠僵菌的蛋白酶活性與其毒力密切相關(guān)。但幾丁質(zhì)酶活力表達(dá)最高的溫度與LA毒力最強(qiáng)的溫度不一致,因此幾丁質(zhì)酶活力不能作為毒力表達(dá)的指標(biāo)。

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