RNA干擾及其在水稻抗病毒基因工程中的應用

何 文, 吳蓓蕾, 李 莉, 王錫鋒

(中國農業(yè)科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

水稻病毒病是由病毒引起的一類系統(tǒng)性侵染病害,世界上已經發(fā)現和確認的水稻病毒病(包括類菌原體病)約有16種,其中在我國發(fā)生的有11種(包括兩種類菌原體病),分別是普通矮縮病、黃葉病、條紋葉枯病、黑條矮縮病、黃萎病、草狀矮縮病、簇矮病、鋸齒葉矮縮病、橙葉病、東格魯病、瘤矮病。中國稻區(qū)廣闊,水稻病毒病可廣泛流行,在病害嚴重流行時,曾十幾個省相繼發(fā)病,暴發(fā)成災,僅一個省(市、自治區(qū))因病損失稻谷即數十萬t。北方粳稻產區(qū)以水稻條紋葉枯病發(fā)生普遍。

水稻條紋葉枯病(ricestripedisease)是由水稻條紋病毒(Ricestripevirus,RSV)引起的一種最嚴重的水稻病毒病害,是通過灰飛虱[Laodelphax striatellus(Fallén)]刺吸以持久性方式傳播,汁液、土壤及種子均不能傳毒。自20世紀80年代末期以來,該病在我國水稻種植區(qū)的發(fā)病率逐年提高,特別是在粳稻種植區(qū),發(fā)生更為普遍。據不完全統(tǒng)計,全國近年該病的發(fā)病面積已達267萬hm2以上,病區(qū)發(fā)病率一般在10%～20%,重者株發(fā)病率達50%～80%,給農民帶來重大經濟損失[1]。

利用水稻品種抗性被認為是防治水稻條紋葉枯病最經濟、有效的方法。用常規(guī)方法培育抗病品種存在育種周期長、效率低,抗病基因與不良性狀連鎖等問題。RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術所具有的特異性、穩(wěn)定性、高效、快速以及不改變基因組的遺傳組成等特性,為基因功能的研究提供了強有力的手段,同時也為轉基因植物抗病毒病害增添了新的策略和方法。

1 RNA干擾(RNAi)

RNA干擾(RNAinterference,RNAi)是指雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)分子引起的序列特異性靶基因mRNA降解,從而導致內源或外源靶基因沉默的機制。

1.1 RNAi的發(fā)現

盡管RNAi現象只是在20世紀90年代以來才被認識并逐漸引起人們的注意,但是第1篇與RNAi相關的文章可能早在 1928年就已發(fā)表。Wingard[2]發(fā)現由煙草環(huán)斑病毒侵染的煙草植株開始時表現出明顯的病癥,但上部葉片的癥狀會逐漸變輕,可以從病毒侵染癥狀中“恢復”過來,并且新長出的葉片可抵抗同源病毒的再次侵染,具有了一定的抗性。當時并沒有有關RNAi機制的任何信息,甚至不知道煙草環(huán)斑病毒的基因組是RNA。不過,這一現象說明了抗性機制的存在可以限制或阻止病毒的再次侵染。1998年,Fire等人[3]將dsRNA注入線蟲(Caenorhabditiselegans)體內后發(fā)現可抑制序列同源基因的表達,抑制主要作用于轉錄之后,并將此現象稱為RNA干擾。此后,RNA干擾現象被證明廣泛存在于真菌、線蟲、果蠅、植物、高等動物等生物中,發(fā)現者也因此獲得了2006年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎。

1.2 RNAi的作用機制

1.2.1 dsRNA的來源

經研究發(fā)現有多種途徑可以產生dsRNA,主要為：1)當基因組的一些隨機位點被插入一段序列的多個拷貝時,側翼啟動子驅動轉錄,轉錄通讀可以產生與該正義鏈序列互補的雙鏈RNA,形成dsRNA;2)對于具有末端反向重復序列的轉座子,轉錄通讀產生的RNA會自身回折形成發(fā)夾結構的dsRNA(hairpinRNA,hpRNA)[4-5];3)幫助細胞識別異常的 RNA(aberrantRNA),并在 RdRP(RNA-dependentRNApolymerase)作用下,轉變成dsRNA[6];4)植物中,RNA病毒感染可以直接引入dsRNA[4-5];5)外源基因以反向重復的形式插入基因組后可轉錄產生hpRNA;6)正義RNA大量表達引起的共抑制,也能誘導dsRNA的產生[7];7)病毒或植物細胞中的miRNA基因,其前體miRNA(premiRNA)被 DCL1加工為 miRNA-miRNA*雙體(即為dsRNA)[8-9]。無論哪種途徑產生的dsRNA,都可引發(fā)RNAi。

1.2.2 RdRp介導的補充途徑

在線蟲、植物、真菌和果蠅中還存在依賴RNA的RNA聚合酶介導的補充途徑,RdRp可能的作用方式有：1)RdRP以siRNA單鏈為引物合成靶mRNA的互補鏈;2)不需要引物直接合成異常RNA的互補鏈;3)在1條mRNA鏈上結合了2條或多條siRNA引物,分別由RdRP延伸后再由RNA連接酶連接成互補鏈;4)dsRNA解旋后,2條鏈均結合上siRNA引物,分別由 RdRP合成互補鏈,新合成的次生dsRNA又被Dicer切割成大量次生siRNA,從而增強了誘導基因沉默的效率[6]。

1.2.3 RNAi的3種主要途徑

通過大量基因抑制現象的研究,以及生化和遺傳學上的分析表明,基因沉默有3種不同的途徑。這3種途徑都包括dsRNA被含有RNaseIII結構域的Dicer酶切割為21～26個核苷酸小分子RNA的過程[10]。目前研究比較清楚且使用較多的基因沉默小分子RNA主要有siRNA(smallinterfering RNA)及miRNA(microRNA)。

圖1 RNA干擾的機制(引自諾貝爾醫(yī)學獎委員會)

1.2.3.1 轉錄后基因沉默(post-transcriptionalgene silencing,PTGS)

PTGS是最普遍的一種沉默機制。此機制主要由siRNA介導[11]。病毒侵染的植物細胞中的dsRNA可能是單鏈RNA病毒的復制中間產物或是其二級結構形態(tài)。至于植物DNA病毒,其dsRNA可能是具有重疊互補序列的轉錄物經由退火形成的。在胞質中的Dicer酶或其類似物(Dicer-like,DCL)的作用下把長鏈dsRNA切割成siRNA,其具5′端磷酸和3′端羥基,此外每條單鏈的3′端均有2～3個突出的非配對的堿基[12-13]。由siRNA中的反義鏈指導形成一種核蛋白體,即RNA誘導的沉默復合體(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),然后siRNA作為引導序列,按照堿基互補配對原則識別靶基因轉錄的 mRNA,并引導 RISC復合體結合mRNA;接著siRNA與mRNA在復合體中換位,內切核酸酶將mRNA切割成21～23nt的片段,特異性地抑制靶基因的表達;另一方面,釋放的siRNA可結合在靶mRNA上作為引物,在 RdRp(RNA-dependentRNAPolymerase)的作用下合成 dsRNA,合成的新的dsRNA又可以發(fā)生RNAi現象,特異地降解靶mRNA[14-16],從而產生級聯放大反應。

1.2.3.2 轉錄水平的基因沉默(transcriptionalgene silencing,TGS)

TGS機制是通過改變靶基因染色質的結構來實現的。許多研究表明,發(fā)生TGS的主要原因是啟動子序列的堿基尤其是胞嘧啶的甲基化。siRNA通過堿基配對原理,指導 DNA甲基化酶結合到DNA的特異部位,引發(fā)該部位DNA中胞嘧啶的甲基化(RNA-directedDNAmethylation,RdDM)及組蛋白H3賴氨酸9的甲基化[17-21],使靶啟動子失去功能,導致下游基因轉錄沉默。另外,DNA甲基化可以阻止轉座酶的生成,從而抑制轉座子的移動,保持遺傳穩(wěn)定,防止遺傳損害[22]。

1.2.3.3 翻譯水平的基因沉默

這種機制主要是由內源的miRNA介導的基因沉默。miRNA是由長度約70nt的RNA形成的莖環(huán)樣前體,經Dicer酶作用后形成長約21～25nt的單鏈RNA,大多數miRNA與底物mRNA不完全配對結合,它們并不改變miRNA的穩(wěn)定性[23-24]。這種抑制方式最終也通過形成RISC發(fā)揮作用,結合在相應的 mRNA的3′末端非翻譯區(qū)(3′-UTR)上,對靶基因進行轉錄后的負調控,而靶mRNA并不發(fā)生變化,所以屬于一種翻譯水平上的抑制效應[25-26]。miRNA和siRNA相同,除了都由Dicer酶加工成熟之外,RNAi必需的Argonaute(alg-1、alg-2)家族基因也是這兩種RNA行使生物功能所必需的。在RNAi過程中形成的RISC復合物既含有siRNA又含有miRNA,此復合物可根據不同情況產生不同效應,若siRNA與靶序列不能嚴格配對(如有單個堿基錯配),則PTGS無法進行,此時復合物轉而利用miRNA抑制核糖體在mRNA上延伸從而在翻譯水平阻斷基因表達[27]。

2 RNAi技術在植物抗病毒研究中的應用

RNAi技術目前已經廣泛應用于植物病毒的防治上。1998年,首次報道了RNAi技術在防治馬鈴薯Y病毒病上的應用,Waterhouse等人利用馬鈴薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段構建IRS(inverted repeatsequence)載體進行煙草轉化,使植株完全免疫[28]。

dsRNA為RNAi的誘導起始物。生物體由于病毒入侵、轉座子轉錄、基因組中反向重復序列轉錄以及外源基因導入等原因都可能產生dsRNA分子。dsRNA的產生有化學合成法、體外轉錄法和轉錄載體體內轉錄法?，F在普遍采用轉錄載體體內轉錄法。

2.1 RNAi表達載體的構建

2.1.1 靶基因序列的選擇

構建高效的RNAi表達載體是應用RNAi技術的關鍵。其中導入的 dsRNA具有特異性是利用RNAi的前提,在保證不影響其他功能的前提下降解病毒基因組。這種特異性是由dsRNA與目的基因的同源序列決定的,所以如果在植物體內還有另外的基因與RNAi作用的基因有同源性,這個基因必定也會受到 RNAi的影響。另外,對于 RNAi的作用位點要經過精心選擇。位點選擇不當還常常會導致脫靶效應(off-targeteffect)。由于siRNAs和靶mRNA可以有一定的錯配和間隙,因此siRNAs可能在一個基因組中作用于上百個潛在的目標序列[29]。現在已經發(fā)展出若干種算法和軟件幫助選擇特異的siRNA靶序列[30],運用科學并相對先進的技術可以幫助盡量避免脫靶效應的產生。目前,RNAi技術在植物抗病毒研究中,主要從兩方面來設計RNAi作用的靶位點：1)以病毒基因組序列為靶位點設計dsRNA,來起到抑制的作用;2)以宿主植物的基因組序列為靶位點設計dsRNA,來起到抑制的作用。前一種方法目前研究和應用的比較多,它是將植物病毒基因組的一部分片段作為RNAi作用的靶位點來設計 dsRNA,從而達到抗病毒的目的。Shuichiro[31]等人分別以馬鈴薯X病毒(Potato virusX,PVX)的外殼蛋白基因和TGBp1基因(這個基因編碼RNA沉默抑制因子)為靶位點來設計siRNA,他們分別選取了這兩個基因的部分片段設計成可產生發(fā)夾結構的反向重復序列,結果表明這兩種siRNA都能干擾PVX的侵染。后一種方法研究和應用的比較少,因為它需要在對宿主植物某些基因功能了解比較清楚的前提下進行。

2.1.2 dsRNA表達結構

對于dsRNA表達結構,人們多采用基因片段反向連接成反向重復序列的方法,可使表達的單鏈RNA自我配對形成發(fā)夾結構RNA(hpRNA),發(fā)夾莖部形成穩(wěn)定的dsRNA可誘導同源的內源基因沉默。通常在片段之間需存在一段間隔區(qū),以便使載體結構更加穩(wěn)定。而用正義方向連接的內含子序列替代hpRNA間隔區(qū),形成帶有內含子結構的ihpRNA(intronsplicinghpRNA)載體,其沉默效率可達到90%以上[32]。Wesley等[33]對此進行了深入的比較研究,其結果表明長度為98～853bp的靶基因反向重復片段能夠高效地導致沉默,其轉化體沉默效率可達66%～100%(平均90%)。另外啟動子強弱對于外源基因的表達水平也有很重要的影響,在構建準備轉化禾本科植物(如水稻)的表達載體時,可用Ubiquitin啟動子等,以獲得較高的干擾程度[34]。

2.2 RNAi技術在抗水稻條紋葉枯病毒中的應用

利用RNAi技術賦予植物體病毒抗性具有高度可行性,目前已有通過RNAi技術獲得抗性的報道。如Pinto等[35]將南方菜豆花葉病毒屬的水稻黃斑駁病毒(Riceyellowmottlevirus,RYMV)復制所需酶的部分基因通過構建載體而轉化水稻,誘發(fā)基因沉默,從而使植物具有對RYMV的抗性,并且這種抗性能穩(wěn)定遺傳3代。馬中良等[36]根據抗水稻矮縮病毒(Ricedwarfvirus,RDV)序列,構建了與其相關的RNA干擾序列,導入水稻中,發(fā)現對水稻矮縮病毒有很高的抗性。

轉病毒外殼蛋白cp基因策略是研究最早、應用最廣泛的抗病毒手段。Hayakawa等[37]和燕義唐等[38-39]將條紋葉枯病毒的cp基因分別導入到粳稻和秈稻中,發(fā)現表達外殼蛋白基因的轉基因水稻植株對 RSV的侵染起到一定的抗性。研究表明,當RSV侵染水稻后,伴隨著病癥的加劇,植物細胞內病毒的外殼蛋白CP和病害特異性蛋白SP發(fā)生積累,而其他病毒蛋白的積累并不明顯,因此推測這兩種蛋白都是致病相關蛋白[40]。劉利華等[41]應用免疫膠體金電鏡技術發(fā)現病毒的CP和SP在寄主組織細胞中的葉綠體和細胞質中都有存在,線粒體中沒有,而細胞核中只有CP分布,這表明CP極有可能是病害的致病相關蛋白,甚至致病性方面比SP更為重要;并且還發(fā)現在葉肉組織細胞壁的胞間連絲中存在CP,據此推測CP也可能與病毒的運輸有關。因此,目前在利用RNAi技術抗水稻條紋葉枯病毒中經常選取病毒的cp基因作為靶位點。代玉華等[42]以水稻條紋葉枯病毒的cp基因為靶標,通過將載體pMCG161和載體pCAMBIA1301雙酶切和連接,構建了一個具有CaMV35S啟動子并且在正反義鏈中間含有一個水稻內含子適于水稻農桿菌轉化的高表達RNAi載體。張恭等[43]利用已公布的水稻條紋葉枯病毒的序列和siRNATargetFinder軟件,獲得了168條siRNA片段,利用這些片段在水稻基因組中BLAST,最終獲得6條與水稻基因組完全不匹配的干擾序列。選擇其中的2條,通過化學合成干擾序列,利用pCAMBIA1301質粒構建了2個RNA干擾載體。這些研究為探索利用RNA干擾技術防治水稻條紋葉枯病奠定了基礎。

3 結語

RNAi技術已經高效地應用于能夠沉默特定植物基因的分子植物育種,并被Science雜志評為2001、2002年度自然科學十大突破之一[44],為目前分子生物學和遺傳學研究熱點。正如諾貝爾生理學或醫(yī)學獎評獎委員會主席戈蘭?漢松說：“我們?yōu)橐环N基本機制的發(fā)現頒獎。這種機制已被全世界的發(fā)明家證明是正確的,是給它發(fā)個諾貝爾獎的時候了。”RNAi技術發(fā)展迅速,以上的研究也說明RNAi技術在應用于抗水稻病毒研究中的巨大潛力。但RNAi也有其自身的不足之處。研究證實即使是有一個堿基的突變,也會對干擾的效果產生巨大的影響[45]。siRNA的脫靶效應也是進行RNAi試驗時需要注意的一個問題[46-47]。并且對于RSV的各基因產物的功能及其在致病性中的作用等方面的研究還很少。盡管仍有一些問題亟待研究,但隨著分子生物學方法和技術的發(fā)展,可以預見上述問題必將一一得到解決,有理由相信利用RNAi技術將在水稻病毒基因功能研究和水稻抗病品種的培育方面發(fā)揮重要作用。

[1]吳書俊,鐘環(huán),左慧,等.水稻抗條紋葉枯病的遺傳與育種研究進展[J].中國農學通報,2007,23(1)：244-248.

[2]Wingard S A.Hosts and symptoms of ring spot,a virus disease of plants[J].Agric Res,1928,37：127-153.

[3]Fire A,Xu S,Montgomery M K,et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J].Nature,1998,391：806-811.

[4]彭昊,王志興,竇道龍,等.由根癌農桿菌介導將葡萄糖氧化酶基因轉入水稻[J].農業(yè)生物技術學報,2003,11(1)：16-19.

[5]Plasterk R H.RNA silencing：the genomes immune system[J].Science,2002,296(5571)：1263-1265.

[6]Hutvagner G,Zamore P D.RNAi：nature abhors a doublestrand[J].Curr Opin Genet Dev,2002,12：225-232.

[7]Beclin C,Boutet S,Waterhouse P,et al.A branched pathway for transgene-induces RNA silencing in plants[J].Curr Biol,2002,12(8)：684-688.

[8]Li J,Yang Z,Yu B,et al.Methylation protects miRNAs and siRNAs from a 3'-end uridylation activity in Arabidopsis[J].Curr Biol,2005,15(16)：1501-1507.

[9]Park M Y,Wu G,Gonzalez-Sulser A,et al.Nuclear processing and export of microRNA in Arabidopsis[J].Proc Natl Acad Sci USA,2005,102(10)：3691-3696.

[10]Baulcombe D.RNA silencing in plants[J].Nature,2004,431：356-363.

[11]Hamilton A J,Baulcombe D C.A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants[J].Science,1999,286：950-952.

[12]Zamore O D.RNA interference：listening to sound of silence[J].Nat Struct Biol,2001,8(9)：749.

[13]Harborth J,Elbashir S M,Becheft K,et al.Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs[J].J Cell Science,2001,114(24)：4557.

[14]Zamore P D,Tuschl T,Sharp P A,et al.RNAi：doublestranded RNA directs the A TP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell,2000,101：25-33.

[15]Winston W M,Molodowitch C,Craig P H.Systemic RNAi in C.elegans requires the putative transmembrane protein SID-1[J].Science,2002,295(5564)：2456-2459.

[16]Jia S,Noma K,Grewal S I.RNAi-independent heterochromatin nucleation by the stress-activated ATF/CREB family proteins[J].Science,2004,304(25)：1971-1976.

[17]Wassenegger M,Heimes S,Riedel L,et al.RNA-directed de novo methylation of genomic sequences in plants[J].Cell 1994,76：567-576.

[18]Mette M F,Aufsatz W,van der Winden J,et al.T ranscriptional silencing and promoter methylation triggered by doublestranded RNA[J].EMBO J,2000,19：5194-5201.

[19]Jones L,Ratcliff F,Baulcombe D C.RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Met1 for maintenance[J].Curr Biol,2001,11(10)：747-757.

[20]Verdel A,Song tao J,Gerber S,et al.RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the R1TS complex[J].Science,2004,303(30)：672-676.

[21]Buratowski S,M oazed D.Gene regulation：expression and silencing coupled[J].Nature,2005,435：1174-1175.

[22]Zeng Y,Wagner E J,Cullen B R.Both natural and designed micro RNAs can inhibit the expression of cognate mRNAs when ex pressed in human cells[J].Mol Cell,2002,9(6)：1327-1333.

[23]Volpe T A,Kidner C,Hall I M,et al.Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi[J].Science,2002,297(5588)：1833-1837.

[24]Denli A M,Tops B B,Plasterk R H,et al.Processing of primary micro RNAs by the microprocessor complex[J].Nature,2004,432(7014)：231-235.

[25]Bartel D P.MicroRNAs：genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2)：281-297.

[26]Bernstein E,Caudy A A,Hammond S M,et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature,2001,409(6818)：363-366.

[27]Hannon G J.RNA interference[J].Nature,2002,418(6894)：244-251.

[28]Waterhouse P M,G raham M W,Wang M B.Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA[J].Proc Natl Acad Sci USA,1998,95(23)：13959-13964.

[29]M a Y,Creanga A,Lum L,et al.Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens[J].Nature,2006,443(7109)：359-363.

[30]Boese Q,Leake D,Reynolds A,et al.Mechanistic insights aid computational short interfering RNA design[J].M ethods Enzymol,2005,392：73-96.

[31]Takahashi S,Komatsu K,Kakizawa S,et al.T he efficiency of interference of Potato virus X infection depends on the target gene[J].Virus Research,2006,116：214-217.

[32]Smith N A,Singh S P,Wang M B.Total silencing by intronspliced hairpin RNAs[J].Nature,2000,407(6802)：319-320.

[33]Wesley S V,Helliwell C A,Smith N A,et al.Construct design for efficient,effective and high-throughput gene silencing in plants[J].Plant J,2001,27(6)：581-590.

[34]Chuang C F,Meyerowitz E M.Specific and heritable genetic interference by double-stranded RNA in Arabidopsis thaliana[J].PNAS,2000,97(9)：4985-4990.

[35]Pinto Y M,Kok R A,Bandcombe D C.Resistance to Rice yellow mottle virus(RYMV)incultivated African rice varieties containing RYMV transgenes[J].Nature Biotechnology,1999,17(7)：702-707.

[36]馬中良,楊懷義,王榮,等.利用轉hpRNA基因水稻抗水稻矮縮病毒[J].植物學報,2004,46(3)：332-336.

[37]Hayakawa T,Zhu Y,Itoh K,et al.Genetically engineered rice resistant to Rice stripe virus,an insect-transmitted virus[J].Proc Natl Acad Sci USA,1992,89：9865-9869.

[38]燕義唐,王晉芳,邱并生,等.水稻條紋葉枯病毒外殼蛋白基因在工程水稻植株中的表達[J].植物學報,1992,34(12)：899-906.

[39]Yan Y T,Wang J F,Qiu B S,et al.Resistance to Rice stripe virus conferred by expression of coat protein in transgenic indica rice plants regenerated from bombarded suspension culture[J].Virologica Sinica,1997,12(3)：260-269.

[40]林奇田,林含新,吳祖建,等.水稻條紋病毒外殼蛋白和病害特異性蛋白在寄主體內的積累[J].福建農業(yè)大學學報,1998,27(3)：322-326.

[41]劉利華.三種水稻病毒病的細胞病理學[D].福州：福建農林大學,1999.

[42]代玉華,王錫鋒,李莉,等.一種適合水稻農桿菌轉化的 RNAi載體的構建和潮霉素對水稻轉化的影響[J].植物保護,2007,33(2)：37-40.

[43]張恭,劉立峰,周維,等.水稻條紋葉枯病毒 RNA干擾載體的構建[J].華北農學報,2008,23(4)：10-13.

[44]江舸,金由辛.微 RNA—Science雜志2002年十大科技突破第一名[J].生命的化學,2003,23(1)：1-3.

[45]Du Q,Thonberg H,Wang J,et al.A systematic analysis of the silencing effects of an active siRNA at all single-nucleotide mismatched target sites[J].Nucleic Acids Res,2005,33(5)：1671-1677.

[46]Saxena S,Jonsson Z O,Dutta A.Small RNAs with imperfect match to endogenous mRN A repress translation.Implications for off-target activity of small inhibitory RNA in mammalian cells[J].J Biol Chem,2003,278(45)：44312-44319.

[47]Ma H T,On K F,T sang Y H,et al.An inducible sy stem for expression and validation of the specificity of short hairpin RNA in mammalian cells[J].Nucleic Acids Res,2007,35(4)：e22.