新病害—山核桃果實黑斑病病原菌的鑒定

張傳清， 徐志宏＊， 孫品雷， 陳為民， 徐炳潮， 俞春來， 包春泉

（1.浙江林學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院植物保護系，臨安 311300； 2.浙江省杭州市森林病蟲防治站，310009；3.浙江省臨安市森林病蟲防治站，311300； 4.浙江省淳安縣森林病蟲防治站，311700；5.浙江省桐廬縣森林病蟲防治站，311500）

胡桃科（Juglandaceae）山核桃屬（Carya）植物是著名的干果樹種，浙江山核桃（C.cathayensis）具有經(jīng)濟價值高、營養(yǎng)豐富等特點，發(fā)展前景廣闊。隨著人民生活水平的提高，山核桃越來越受到人們的重視，產(chǎn)品供不應(yīng)求，僅浙江臨安的栽培面積就超過2.5萬hm2。2007年，浙江杭州地區(qū)（臨安、淳安和桐廬市）、安徽寧國等地山核桃的果實出現(xiàn)了一種新的病害—果實黑斑病，農(nóng)戶形象地稱之為山核桃“黑籽病”或“花籽病”。該病害于幼果期開始表現(xiàn)癥狀，起初在幼果上形成小黑點，發(fā)展成直徑1～2 cm左右的近圓形稍凹陷的黑斑，后病斑不斷擴大連接成大片不規(guī)則形狀的黑斑。至山核桃成熟時除了在果皮上形成大片黑斑外，還會導(dǎo)致內(nèi)部果肉發(fā)黑，口感苦澀，嚴重影響山核桃的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前該病害有逐年加重的趨勢，2008年浙江臨安、淳安和桐廬等山核桃主產(chǎn)區(qū)的平均病果率達5%，嚴重的地區(qū)超過20%。但還沒有該病害病原物的相關(guān)報道，類似病害在胡桃科作物上也未見報道，由此導(dǎo)致對該病害的防治十分盲目，無法采取針對性的措施。因此，作者于2008年從不同地區(qū)采集山核桃病果，進行了病原菌分離和鑒定。

1 材料與方法

1.1 病原菌分離、純化與培養(yǎng)

2008年6－8月從不同地區(qū)采集具有典型癥狀的病果（圖1），帶回實驗室進行常規(guī)組織分離。分離物采用常規(guī)方法進行單孢純化，純化獲得的菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察其培養(yǎng)特征，7 d后用無菌水洗下孢子，顯微觀察其形態(tài)特征。

1.2 分離物的回接與再分離

采用離體幼果接種法。從無該病發(fā)生的地區(qū)采集健康的山核桃幼果，將其放置于直徑9 cm的培養(yǎng)皿內(nèi)，底部用含無菌水的濾紙保濕。隨機選取HT－3、HT－38和HT－16等10個菌株，在PDA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7 d后用含0.01%吐溫－80的無菌水洗下孢子并調(diào)節(jié)濃度至106個／ML，用喉頭噴霧器將上述分生孢子懸浮液噴在山核桃幼果表面。以含0.01%吐溫－80的無菌水為對照（CK）。每個菌株3次重復(fù)，每次重復(fù)接種2顆果實。接種后的果實放在25℃，L∥D＝12 h∥12 h，85%RH條件下培養(yǎng)。果實發(fā)病后進行病原菌的再分離。

1.3 r DNA ITS擴增所用引物

采用擴增真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）的通用引物［1］，由上海生工合成。上游引物ITS1（5′－TCCGTAGTGAACCTGCGG－3′），下游引物ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）。

1.4 DNA提取

各菌株在PDA培養(yǎng)基上于25℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d后，用滅菌載玻片刮取菌絲。DNA提取采用UNIQ－10柱式植物基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）。

1.5 ITS的PCR擴增和序列測定

PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個循環(huán)；72℃保溫10 min［1］。DNA序列測定委托上海英駿有限公司進行。測得的序列通過BLAST進行比對。

圖1 山核桃果實黑斑病的田間癥狀

2 結(jié)果與分析

2.1 分離物的培養(yǎng)和形態(tài)特征

從不同地區(qū)不同時間采集的病果都分離得到了同一種真菌，該菌在PDA培養(yǎng)基上形成白色菌落，具明顯的同心輪紋。分生孢子盤球形，直徑108～220μm。分生孢子長梭形，直或彎曲，（22.6～29.9）μm×（6.1～9.0）μm，5個細胞、中間3個有色孢（上部2個為黑褐色、下部1個為淡橄欖色），孢子頂生2～3根附屬絲、多為3根，15.8～33.6μm，附屬絲末端無匙狀膨大（圖2）。根據(jù)上述培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征將其初步鑒定為小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsismicrospora）。

圖2 山核桃果實黑斑病病原菌的分生孢子形態(tài)

2.2 分離物的致病性

HT－3、HT－38和 HT－16等隨機選擇的10個菌株通過離體幼果接種7 d后都出現(xiàn)了明顯的癥狀：果面上形成不規(guī)則形狀的黑斑（圖3）。該癥狀與田間病果一致，而對照果實保持健康，沒有出現(xiàn)任何癥狀。

圖3 山核桃果實黑斑病病原菌的人工接種結(jié)果

2.3 病原菌的ITS序列

HT－3、HT－38和 HT－16等10個菌株經(jīng)PCR后都獲得500 bp左右的片段，測序結(jié)果表明供試的菌株間序列完全一致。本病原菌的ITS序列（GenBank登錄號：FJ947050）與小孢擬盤多毛孢（P.microspora）多個菌株（GenBank登錄號：FJ459951.1，F(xiàn)J459950.1，F(xiàn)J459949.1和EU279435.1）的序列一致性達100%。

綜合上述培養(yǎng)性狀和分生孢子的形態(tài)特征，將引起山核桃果實黑斑病的病原菌鑒定為小孢擬盤多毛孢（P.microspora）。

3 討論

前人研究認為分生孢子中間色胞顏色類型即淡色（褐色至橄欖色）和暗色（暗褐色或煤煙色至褐色）是擬盤多毛孢屬首要的分類特征，分生孢子頂端附屬絲末端匙狀膨大與否是第二重要的分類特征，此外分生孢子的長度和寬度等也是重要的分類特征［2－3］。韋繼光等提出單純依賴形態(tài)特征鑒定擬盤多毛孢的種類會存在較大的誤差，而應(yīng)該綜合形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)特征進行界定［4］。

本研究于不同時間從采自不同地區(qū)山核桃果實黑斑病病果上都分離出了同一種優(yōu)勢的真菌，其在接種時能引起與自然發(fā)病相同的癥狀，說明本研究獲得的分離物是山核桃果實黑斑病的病原菌。該真菌在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)特征和Pestalotiopsis一致。本研究在綜合病原物的培養(yǎng)性狀、形態(tài)特征和ITS序列后認為，山核桃果實黑斑病的病原為小孢擬盤多毛孢（P.microspora）。雖然從病果上也分離到了少量葡萄座腔菌屬和鏈格孢屬2種真菌，但它們在接種時都不能引起健康的山核桃果實發(fā)病。目前還未見其他山核桃屬植物上有關(guān)Pestalotiopsis引起果實病害的報道。下一步需要對病害循環(huán)和防治措施進行針對性的研究，以解決生產(chǎn)上盲目防治的問題。

［1］張劍.小孢擬盤多毛孢的鑒定與除草活性物質(zhì)分析［D］.保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［2］Guba E F.Monograph ofMonochaetiaandPestalotia［M］.Massachusetts：Harvard University Press，1961.

［3］劉愛榮.海南植物內(nèi)生擬盤多毛孢的多樣性及擬盤多毛孢屬分子系統(tǒng)學(xué)研究 ［D］.杭州：浙江大學(xué)，2006.

［4］韋繼光，徐同，郭良棟，等.根據(jù)形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)學(xué)特征界定擬盤多毛孢屬的種［J］.廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2005，24（4）：304－313.