流體剪切力對(duì) M *C3T3-E1細(xì)胞 O PG、RANKL蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究

張 超 夏亞一 李 鵬 何萬慶 王海明 汪 靜 王翠芳

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科研究所,蘭州 730030)

自 1997年發(fā)現(xiàn)骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)和細(xì)胞核因子 κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand,RANKL)后,大量的研究結(jié)果顯示 OPG與 RANKL的平衡直接影響著骨組織代謝[1,2]。RANKL是一種膜結(jié)合蛋白,它可以和前破骨細(xì)胞上的細(xì)胞核因子κB受體活化因子(receptor activator of NF-κB,RANK)結(jié)合從而激活前破骨細(xì)胞[3],使其分化為破骨細(xì)胞,故也稱為破骨細(xì)胞分化因子(osteoclastdifferentiation factor,ODF),在骨質(zhì)形成和吸收中發(fā)揮作用。間質(zhì)和成骨細(xì)胞都可表達(dá)OPG,它是RANK的一種競爭性抑制劑[4],OPG與RANKL結(jié)合不但阻止骨組織的吸收,而且減少了破骨細(xì)胞的產(chǎn)生。因此,深入探討流體剪切力(fluid shear stress,FSS)作用下 OPG和 RANKL的蛋白表達(dá)機(jī)制是很有必要的。以往的研究證實(shí),應(yīng)力刺激可以影響成骨細(xì)胞中前列腺素 E2(PGE2)、雌激素、TNF、IL、等因子的表達(dá)[5～7],這些因子又分別通過不同的途徑對(duì) OPG和 RANKL的表達(dá)產(chǎn)生影響,進(jìn)而調(diào)節(jié)骨組織的代謝。本實(shí)驗(yàn)通過研究處于骨組織代謝中心環(huán)節(jié)的兩種分子 OPG和 RANKL在不同時(shí)段的流體剪切力作用下蛋白表達(dá)的變化,探討流體剪切力對(duì)促進(jìn)骨組織形成和抑制骨組織吸收的作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠胚胎細(xì)胞系 MC3T3-E1細(xì)胞植入無菌細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,瓶中加入含有 10%胎牛血清和 100 U/ml青霉素、鏈霉素的培養(yǎng)基,放入溫度 37℃、CO2飽和度 5%的孵育箱中培養(yǎng),細(xì)胞每隔 3天換液一次。同時(shí)觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài),當(dāng)細(xì)胞生長面積達(dá)到瓶底面積的 80%時(shí),用 0.25%胰酶 -0.1%Ⅱ型膠原酶消化,按照 5×105個(gè)細(xì)胞接種于無菌培養(yǎng)瓶中,取第三代穩(wěn)定的傳代細(xì)胞用于應(yīng)力加載實(shí)驗(yàn)。

1.2 應(yīng)力加載裝置

應(yīng)力加載系統(tǒng)由蠕動(dòng)泵、硅膠導(dǎo)管、流體小室、儲(chǔ)液管組成。儲(chǔ)液管、硅膠導(dǎo)管和流體小室形成了一個(gè)閉合的回路,用蠕動(dòng)泵擠壓使得液體流動(dòng)。其中流體小室由兩塊透明的有機(jī)玻璃組成,上方的有機(jī)玻璃前端和后端分別有進(jìn)液口和出液口通過硅膠導(dǎo)管與儲(chǔ)液管相連,下方的有機(jī)玻璃板中間鑿有載玻片大小的凹槽,以便載玻片全部卡入凹槽,使細(xì)胞受到流體剪切力作用。流體小室的尺寸設(shè)計(jì)基于Poiseuille流動(dòng)腔模型[8],置入蓋玻片的凹槽長5cm,寬 2.5cm,高 0.2mm。該凹槽的大小滿足長、寬遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于高,長/高遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 10,能夠保證液體流過時(shí)層流、二維流動(dòng)充分發(fā)展為標(biāo)準(zhǔn)的液流,使得實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均勻受力。流室底面剪切力計(jì)算公式是：τ=6ηQ/H2×W。η：流體液的黏滯系數(shù)(dyn/cm2);Q：單位時(shí)間內(nèi)流經(jīng)流體小室的液量(cm2/s);H：流室高度(cm);W：流室寬度(cm)。

1.3 細(xì)胞爬片加力

對(duì)狀態(tài)良好的 MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行消化,按照1×106個(gè)細(xì)胞均勻接種到放有蓋玻片(用Ⅰ型鼠尾膠原包被,以便細(xì)胞爬片)的無菌培養(yǎng)皿中,每次傳4個(gè)培養(yǎng)皿,每個(gè)皿中放入3張蓋玻片(10張進(jìn)行實(shí)驗(yàn),即 OPG和 RANKL實(shí)驗(yàn)組各 5張,分別加載 0,30,60,90,120min的流體剪切力;另外 2張作為備用),然后將培養(yǎng)皿置于 CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),待細(xì)胞均勻爬滿蓋玻片,以備加力時(shí)使用。將滅菌后的加力裝置連接好放入37℃恒溫箱內(nèi),儲(chǔ)液管中加入 40 ml培養(yǎng)基作為流體液。在無菌條件下,迅速取出爬滿細(xì)胞的蓋玻片,細(xì)胞面向上嵌入流體小室下層的凹槽中,啟動(dòng)精密蠕動(dòng)泵提供 12 dyn/cm2的流體剪切力對(duì)細(xì)胞進(jìn)行加力,加力裝置連接 5%CO2以維持流體液 pH值在 7.2～7.4之間。

1.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

將完成加力后的蓋玻片放入準(zhǔn)備好的培養(yǎng)皿中,用 0.01%磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)沖洗 10 min,吸出洗液加入 4%多聚甲醛固定細(xì)胞,室溫孵育 10min,棄多聚甲醛后 PBS沖洗 3次,每次 5 min,加入 0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)透化去交聯(lián) 5min,棄 TritonX-100后 PBS沖洗 10min,加入 1%牛血清白蛋白封閉非特異性位點(diǎn) 30min,PBS沖洗 10min,棄液。每張爬片滴加 30μl稀釋好的一抗(1∶100),放入濕盒 4℃冰箱孵育過夜。次日,PBS沖洗 3次,每次 10 min,避光條件下加入 30μl稀釋好的二抗(1∶150),室溫孵育 30min,PBS沖洗 3次,每次 10 min,封片后熒光顯微鏡下鏡檢每張玻片選 2個(gè)不同的視野拍照。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次,用 IPP軟件分析各水平蛋白表達(dá)的累積光密度值。

1.5 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)

將完成加力的蓋玻片迅速放入冰盒內(nèi),PBS沖洗 2次,加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解,所得的產(chǎn)物即為總蛋白,運(yùn)用 Bradford法可以測定各加力水平細(xì)胞的總蛋白濃度,將樣本以相同的蛋白量加入電泳槽中,選擇 6%(分離膠)和 12%(濃縮膠)的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜,轉(zhuǎn)膜后用 PBS漂洗 30 min,5%脫脂奶粉封閉 2 h后,再次洗膜 30 min,加入一抗(1∶500)4℃冰箱孵育過夜。次日,再次洗膜 30 min,加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(1∶1000),室溫下孵育 60 min,暗室中細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)顯色液顯影,X光膠片曝光。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3次,IPP軟件分析各水平蛋白表達(dá)的累積光密度值。

1.6 軟件分析

2 結(jié)果

2.1 OPG和 RANKL的蛋白表達(dá)

運(yùn)用 12 dyn/cm2的流體剪切力對(duì) MC3T3-E1細(xì)胞分別加載 0,30,60,90,120min后,熒光顯微鏡下觀察 OPG和 RANKL不同時(shí)間段的表達(dá)情況(圖1)。運(yùn)用積分光密度值對(duì)不同時(shí)間段 OPG和RANKL在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況進(jìn)行半定量分析。結(jié)果顯示：FSS作用 30,60,90,120min后能夠顯著增加 OPG的蛋白表達(dá)(P＜0.05),圖1中隨著加力時(shí)間的延長,OPG熒光亮度增加,這表明 OPG的蛋白表達(dá)相應(yīng)增加;同時(shí) FSS也可以減少 RANKL的蛋白表達(dá),但是該作用沒有 OPG的變化顯著,圖1中隨著加力時(shí)間的延長,RANKL熒光亮度降低,這表明 RANKL的蛋白表達(dá)相應(yīng)減少。兩者共同作用,隨著加力時(shí)間的延長,OPG/RANKL值顯著增高(P＜0.05)。具體數(shù)據(jù)見表1。

圖1 OPG和 RANKL在 FSS作用不同時(shí)間后免疫熒光表達(dá)(×40)

表1 FSS作用不同時(shí)間 OPG和RANKL的積分光密度值(免疫熒光)(±s,n=30)

4個(gè)實(shí)驗(yàn)組 OPG、RANKL、OPG/RANKL與對(duì)照組兩兩比較,均 P=0.000

組別 OPG RANKL OPG/RANKL對(duì)照組：0min組 11512.564±131.552 15765.541±97.360 0.730±0.143實(shí)驗(yàn)組：30min組 12350.230±109.356 14586.032±124.183 0.847±0.205 60min組 15583.867±86.423 13662.115±103.854 1.141±0.135 90min組 18436.716±162.928 12974.861±79.481 1.421±0.197 120min組 19155.357±138.721 12539.857±117.587 1.512±0.151 F值P值99.852 0.000 25.149 0.000 62.288 0.000

2.2 OPG及 RANKL蛋白印跡結(jié)果

運(yùn)用 12 dyn/cm2的流體剪切力對(duì) MC3T3-E1細(xì)胞分別加載 0,30,60,90,120 min后,采用 Western blotting方法研究 OPG和 RANKL在不同時(shí)間段的表達(dá)情況(圖2)。通過積分光密度值對(duì)不同時(shí)間段OPG和 RANKL在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明：FSS作用30min后,OPG的表達(dá)開始增加,當(dāng)作用 60 min后,OPG的增長趨勢到達(dá)高峰,與 0 min相比增加了 50%左右,而后增長趨勢有所減慢,但各組之間增加顯著(P＜0.05);同時(shí) FSS也可以減少 RANKL的表達(dá),這一作用在 90 min時(shí)達(dá)到高峰,與 0min相比減少了 30%左右,但 RANKL的變化趨勢相對(duì)較緩。兩者共同作用,隨著加力時(shí)間的延長,OPG/RANKL值顯著增高。具體數(shù)據(jù)見表2。

3 討論

應(yīng)力包括基底牽張力、流體剪切力和壓應(yīng)力等,骨細(xì)胞所能感受到的應(yīng)力強(qiáng)度為 8～30 dyn/cm2[9,10]。盡管骨組織特殊的腔隙——小管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)決定了流體剪切力對(duì)骨組織的特殊作用[11],但是有關(guān)流體剪切力作用下成骨細(xì)胞所做出應(yīng)答的研究卻較少。本實(shí)驗(yàn)通過調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)數(shù)將流體剪切力控制在 12 dyn/cm2對(duì) MC3T3-E1細(xì)胞中 OPG和 RANKL的蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究,因?yàn)?OPG和RANKL的表達(dá)直接影響著成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的功能,進(jìn)而影響著骨組織形成與代謝的動(dòng)態(tài)平衡,因此將 OPG/RANKL的比值作為量化成骨活性的標(biāo)準(zhǔn),從而揭示流體剪切力對(duì)骨組織代謝的調(diào)節(jié)作用。

圖2 OPG和 RANKL在 FSS作用不同時(shí)間后蛋白印跡表達(dá)

表2 FSS作用不同時(shí)間 OPG和RANKL的積分光密度值(蛋白印跡)(±s,n=30)

表2 FSS作用不同時(shí)間 OPG和RANKL的積分光密度值(蛋白印跡)(±s,n=30)

各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兩兩比較,OPG 0min vs 30min P=0.011,RANKL 0min vs 30min P=0.007,其余均 P=0.000

組別 OPG累積光密度值 RANKL累積光密度值 OPG/RANKL對(duì)照組：0min組 1356.522±35.764 4596.614±58.260 0.293±0.142實(shí)驗(yàn)組：30min組 1840.176±48.358 3673.850±42.873 0.506±0.131 60min組 3245.201±41.701 2407.621±49.337 1.335±0.165 90min組 4022.183±59.235 2086.316±37.641 1.940±0.170 120min組 4470.967±51.639 1782.365±31.353 2.511±0.149 F值 109.757 51.297 76.173 P值 0.000 0.000 0.012

Tyrovola等[12]證實(shí) RANKL可以與前破骨細(xì)胞上的 RANK結(jié)合從而激活前破骨細(xì)胞,使其分化為破骨細(xì)胞,使得骨組織向著加速吸收的方向發(fā)展。而 OPG是 RANK的一種競爭性抑制劑,OPG與RANKL結(jié)合不但阻止骨組織的吸收,而且減少了破骨細(xì)胞的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)中,空白組(0min)細(xì)胞處于靜態(tài)培養(yǎng)狀態(tài)下,OPG的表達(dá)較少,相應(yīng)的 RANKL的蛋白表達(dá)則較為豐富。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長,RANKL的表達(dá)繼續(xù)增加,這導(dǎo)致 OPG/RANKL的比值降低,RANKL的增多可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成,使骨組織代謝向著加快吸收的方向發(fā)展,這也許可以說明長期臥床缺乏運(yùn)動(dòng)的病人由于應(yīng)力對(duì)骨骼的刺激減少,使得 OPG的表達(dá)減少,相反 RANKL的表達(dá)增加,破骨細(xì)胞形成增多,最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

成骨細(xì)胞對(duì) FSS的響應(yīng)要經(jīng)歷一個(gè)短暫的潛伏期,但 FSS的作用較顯著。加力 30min后,阻滯了OPG/RANKL變小的趨勢,蛋白檢測提示 FSS促進(jìn)了 OPG的表達(dá),抑制了 RANKL的表達(dá),二者的協(xié)同作用使 OPG/RANKL的比值較 0 min組有所增加,但這種增加較輕微,可能是 FSS對(duì) MC3T3-E1細(xì)胞的作用要經(jīng)歷一個(gè)短暫的潛伏期。盡管 Rubin等[13]運(yùn)用基底形變給小鼠骨細(xì)胞加力也使得OPG/RANKL的比值增加,但是與基底牽張力只減少RANKL的量相比,本實(shí)驗(yàn)中 FSS一方面增加 OPG的表達(dá),另一方面還減少 RANKL的表達(dá),使OPG/PANKL的比值增加更顯著。

骨骼細(xì)胞對(duì)流體剪切力作用更加敏感且有效。加力 60min后,OPG/RANKL的比值增長最為顯著。在這一時(shí)期,FSS進(jìn)一步促進(jìn)了 OPG的表達(dá),相反RANKL的蛋白表達(dá)則被抑制。FSS在促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生的同時(shí)也抑制了破骨細(xì)胞的形成和活化,從而抑制了骨組織的吸收,使得骨組織向著成骨的方向發(fā)展。Wang等[14]用基底牽張力給成骨細(xì)胞加力,需要 6～12 h的連續(xù)作用才能有效,而 FSS的作用在 60min后就顯示出同樣的效果,這說明成骨細(xì)胞對(duì) FSS響應(yīng)更快。各種形式的應(yīng)力最終以牽拉和剪切的形式作用于骨骼細(xì)胞,其中又以 FSS作用最為重要。劉易軍等[15]證實(shí),FSS可以在很短時(shí)間內(nèi)增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子的水平,可在數(shù)十分鐘內(nèi)增加前列腺素的產(chǎn)量,而前列腺素可以在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致RANKL表達(dá)減少,同時(shí)使 OPG表達(dá)增加。這也與我們的研究不謀而合,加力60min后OPG的表達(dá)增加最大,RANKL減少最多,OPG/RANKL增加最顯著。同時(shí),Kanzaki等[16]運(yùn)用擠壓力對(duì)牙周膜細(xì)胞進(jìn)行加力時(shí)觀察到,RANKL的表達(dá)有所增加,但是OPG的表達(dá)沒有發(fā)生變化。Maddi等[17]運(yùn)用超聲波對(duì)成骨細(xì)胞進(jìn)行作用,觀察到與對(duì)照相比 OPG的表達(dá)明顯增加,但 RANKL的表達(dá)無變化。相比之下,本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用 FSS對(duì) MC3T3-E1細(xì)胞加力,一方面增加了 OPG的表達(dá),另一方面抑制了 RANKL的表達(dá),二者的協(xié)同作用使 OPG/RANKL顯著增加。這些結(jié)果提示,與其他機(jī)械刺激相比,FSS對(duì)成骨細(xì)胞中 OPG和 RANKL的表達(dá)更加有效。

流體剪切力對(duì) OPG和 RANKL的作用影響骨組織形成與吸收的動(dòng)態(tài)平衡。加力 90 min后,OPG/RANKL的比值仍在增大,但 OPG的增長及RANKL的減少趨勢較 60 min時(shí)相對(duì)放緩,說明成骨組織逐漸適應(yīng)了 FSS的作用,對(duì) FSS的敏感性有所下降。在 120 min內(nèi),加力的時(shí)間越長,OPG/RANKL的比值增長得越多,這說明對(duì)成骨細(xì)胞而言FSS可能具有劑量依賴性和可蓄積性。張成俊等[18]證實(shí),一些影響成骨細(xì)胞增殖周期的因子CDK 2和 CDK 4對(duì) FSS作用也具有劑量依賴性和可蓄積性。與 Tintut等[19,20]相同,本實(shí)驗(yàn)中流體剪切力對(duì) OPG和 RANKL的作用使得大量的 OPG中和了 RANKL,造成破骨細(xì)胞的產(chǎn)生和活化障礙并且促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡,進(jìn)一步影響了骨組織新陳代謝的動(dòng)態(tài)平衡。

在本研究中,流體剪切力對(duì) OPG和 RANKL的影響在蛋白水平被定量化,流體剪切力作為骨組織新陳代謝的重要調(diào)節(jié)器之一得到驗(yàn)證,流體剪切力對(duì) OPG的上調(diào)和對(duì) RANKL的下調(diào)作用直接影響著成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞,進(jìn)而影響骨組織代謝的動(dòng)態(tài)平衡,有關(guān)這方面的研究將在骨組織形成和修復(fù)、生物工程、骨質(zhì)疏松及骨病的研究和治療中發(fā)揮巨大的作用。因此,詳盡地研究流體剪切力與骨組織的關(guān)系對(duì)了解骨組織的作用具有重大意義。

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