奶牛乳房炎致病菌的分離和鑒定

張桂賢 （臨沂師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 276005）

我國奶牛乳房炎發(fā)病率高達70%～80%[1]。而奶牛乳房炎是造成奶牛業(yè)損失最多的一種疾病[2]，。山東作為畜牧大省，奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展很快，但受到飼養(yǎng)管理水平及疾病防治技術(shù)的限制，奶牛乳房炎發(fā)病率較高，而目前濫用抗生素的現(xiàn)象十分普通，造成許多病原微生物的耐藥性，給乳房炎的治療帶來很大的困難。針對以上原因本試驗對臨沂市蘭山區(qū)各養(yǎng)殖戶的乳樣進行乳房炎致病菌的分離鑒定，旨在為該地區(qū)奶牛乳房炎的治療提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 乳樣及采集

乳樣來自臨沂市蘭山區(qū)各奶牛養(yǎng)殖戶，共采樣45份，采樣前先用溫水清洗采樣乳頭，再用75%酒精棉消毒乳頭，在每次清洗或消毒乳頭后均用消毒紙巾擦干，棄去采樣乳區(qū)的頭2把乳，然后采集乳汁約10～l5 ml，擠入滅菌瓶中，帖好標(biāo)簽后及時送檢(期間在4℃冰箱保存，待檢)。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

麥康凱瓊脂、伊紅美藍瓊脂、三糖鐵瓊脂、兔鮮血瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、65%的氯化鈉肉湯等均按文獻[3]自配；細菌生化微量鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；乳腺炎診斷液(SMT試劑，自配，配置方法：十二烷硫酸鈉20g，草酚藍20mg，蒸餾水1000ml，調(diào)整pH至6.2～6.4)[4]。

1.3 乳房炎陽性乳的檢測

在每個平皿中倒2ml乳樣，加入等量診斷液，將平皿平置旋轉(zhuǎn)搖動，使診斷液與乳汁充分混合，經(jīng)10s后觀察，根據(jù)混合液有無絮狀物及沉淀程度來判定結(jié)果混合液均勻，流動性好，無絮狀物(陰性-)；有少許絮狀物或沉淀產(chǎn)生(弱陽性+)；有明顯絮狀物或沉淀產(chǎn)生(陽性++)；絮狀物或沉淀粘集成凝膠狀或成凝膠狀團塊(強陽性+++或++++)[5]。

1.4 乳房炎病原菌的分離培養(yǎng)

將分離出有乳房炎的乳樣各取10ml，加入滅菌離心管中做好標(biāo)記，以2500r/min離心15min，棄去管中上層液體，留取底部沉淀物。將沉淀物分別劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂、兔鮮血瓊脂、麥康凱、伊紅美藍平板，置于溫箱37℃培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)特征，選取典型菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢并將其進一步純化培養(yǎng)。

1.5 乳房炎病原菌的鑒定[6,7,8]

1.5.1 球菌的鑒定 鏡檢其形態(tài)呈球形，多集成堆，在普通營養(yǎng)瓊脂和鮮血瓊脂平板呈圓、黃色或灰白色菌落，觸酶試驗和凝固酶試驗陽性，即可判斷為金黃色葡萄球菌。當(dāng)鏡檢呈球形多為鏈狀排列，觸酶試驗陰性，即可鑒定為鏈球菌。當(dāng)細菌CAMP試驗陽性，不水解七葉苷和馬尿酸鈉，即為無乳鏈球菌；當(dāng)細菌CAMP試驗陽性，水解七葉苷和馬尿酸鈉，即為乳房鏈球菌。

1.5.2 桿菌的鑒定 鏡檢為革蘭氏陰性桿狀，在麥康凱瓊脂平板上呈粉紅色菌落，在伊紅美藍瓊脂平板上呈黑色帶金屬光澤的菌落，在三糖鐵瓊脂產(chǎn)酸(或產(chǎn)氣)，不分解尿素，氧化酶試驗陰性和V-P試驗陰性即可鑒定為大腸埃希氏菌。

1.6 藥敏試驗

選用青霉素、氨芐青霉素、先鋒V(頭孢唑啉鈉)、慶大霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明、紅霉素、氯霉素、氟哌酸(諾氟沙星)、阿米卡星(丁胺卡那霉素)10種常用藥物的藥敏試紙采用紙片擴散法[9]對分離菌株做藥敏試驗，測抑菌圈直徑(包括藥敏紙片直徑)，計算同一類菌不同菌株的平均抑菌直徑(當(dāng)直徑<10mm為耐藥，10≤直徑<15mm時為中度敏感，直徑≥15mm為高度敏感。

2 結(jié)果

2.1 陽性乳檢測結(jié)果

乳樣經(jīng)過乳房炎診斷液檢測，45份乳樣中11份為陰性，34份陽性(其中27份為強陽性)。

2.2 乳房炎病原菌的分離培養(yǎng)及鑒定結(jié)果

對34份陽性乳進行系統(tǒng)的細菌分離培養(yǎng)、染色、鏡檢(結(jié)果見圖1、2、3)和生化試驗鑒定出3種52株細菌，其中大腸桿菌12株、無乳鏈球菌14株、乳房鏈球菌20、金黃色葡萄球菌6株，其它株為雜菌。

圖1 黃色菌株(金黃色葡萄球菌)鏡檢結(jié)果

圖2 灰白色菌株(鏈球菌)鏡檢結(jié)果

圖3 分離菌(大腸桿菌)鏡檢結(jié)果

圖4 大腸桿菌藥敏試驗結(jié)果

圖5 鏈球菌藥敏試驗結(jié)果

圖6 金黃色色葡萄球菌藥敏試驗結(jié)果

2.3 藥敏試驗結(jié)果

對篩選的病原菌進行藥敏試驗，結(jié)果(見圖4、5、6、表1)表明大腸桿菌對先鋒V、氯霉素、阿米卡星、復(fù)方新諾明高度敏感；鏈球菌對青霉素、先鋒V、慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、氟哌酸、阿米卡星高度敏感；金黃色葡萄球菌對青霉素、先鋒V、慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、氟哌酸、阿米卡星高度敏感。

表1 三種病原菌藥敏試驗結(jié)果(抑菌直徑) （mm）

3 討論

（1）蘭山區(qū)乳樣檢測結(jié)果表明，鏈球菌是引起奶牛乳房炎的主要致病菌，其次是大腸桿菌和金黃色葡萄球菌。藥敏試驗表明大腸桿菌對先鋒V、氯霉素、阿米卡星、復(fù)方新諾明高度敏感；鏈球菌對青霉素、先鋒V、慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、氟哌酸、阿米卡星高度敏感；金黃色葡萄球菌對青霉素、先鋒V、慶大霉素、鏈霉素、氯霉素、氟哌酸、阿米卡星高度敏感。由于抗菌藥物的廣泛應(yīng)用和耐藥菌株的增多，細菌對常用抗生素的耐藥性愈來愈強，給奶牛乳房炎治療的選擇用藥帶來很大困難，因此對奶牛乳房炎的治療要有地區(qū)針對性，試驗表明該地區(qū)奶牛乳房炎治療首選藥物為先鋒V、氯霉素和阿米卡星。

（2）大腸桿菌性乳房炎是環(huán)境因素導(dǎo)致乳房炎的典型例子，鏈球菌和金黃色葡萄球菌則是通過接觸傳染導(dǎo)致發(fā)病[10]。所以向養(yǎng)殖戶普及奶?？茖W(xué)飼養(yǎng)知識，嚴(yán)格飼養(yǎng)管理，能有效降低蘭山區(qū)奶牛乳房炎的發(fā)病率，為奶牛養(yǎng)殖戶挽回不必要的經(jīng)濟損失。

（3）抗生素是奶牛乳房炎治療的一種普遍而有效的手段，但不能徹底根治乳房炎，其在乳品中的殘留對人類健康造成威脅，而中藥治療則避免了抗生素的不足，但因其應(yīng)用效果不穩(wěn)定、劑型少、藥理作用不完全清晰等缺點[11]，給奶牛乳房炎治療也帶來了一定的限制。因此在奶牛乳房炎的治療途徑上可以考慮中西醫(yī)結(jié)合治療等以達到最佳治療效果。

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[4]周慶新,李錦春,雷彬.奶牛隱性乳房炎的病原分離及藥敏試驗報告

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[5]倪語星,洪秀華. 細菌耐藥性監(jiān)測與抗感染治療[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2002.

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[11]劉瑞生,張洪波,王必慧.中草藥防治奶牛乳房炎研究進展[J].中國動物保健,2008,(12):10-11.