204株肺炎鏈球菌的分離鑒定與耐藥性分析

張 曦

四川省自貢市第四人民醫(yī)院（643000）

肺炎鏈球菌（streptococcus pneumoniae）為鏈球菌科、鏈球菌屬細菌，革蘭染色陽性。它不產(chǎn)生內(nèi)、外毒素，其致病性主要是莢膜的侵襲作用。根據(jù)莢膜抗原性，肺炎鏈球菌已分出86個血清型，成人致病菌以1～9型居多，其中第3型毒力最強；而兒童多為6、14、19及23型。它常寄生于人體鼻咽部，是社區(qū)獲得性肺炎的主要致病原之一，而且它還可引起腦膜炎、心內(nèi)膜炎、中耳炎、鼻竇炎、敗血癥等疾病。美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）規(guī)定，最小抑菌濃度（MIC）≥2μg/mL為青霉素耐藥肺炎鏈球菌（PRSP），MIC為0.12～1.0μg/mL為青霉素中度耐藥（PISP）或稱低度耐藥肺炎鏈球菌，MIC≤0.06μg/mL為青霉素敏感肺炎鏈球菌（PSSP），PNSP包括PRSP和PISP。近年來，肺炎鏈球菌對青霉素等多種抗菌藥物耐藥性在全球普遍呈上升趨勢。為了解自貢市第四人民醫(yī)院近幾年的肺炎鏈球菌耐藥情況，本文對自貢市第四人民醫(yī)院肺炎鏈球菌耐藥情況進行了分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2006年7月至2009年6月自貢市第四人民醫(yī)院門診和住院患者分離、培養(yǎng)肺炎鏈球菌共204株，其中痰標本67.2% （137 /204）、鼻咽拭子24.5%（50/204）、血液標本7.3% （15/204）、引流液和膿汁1.0% （2/204） 。

1.2 試劑與材料

MH基礎(chǔ)瓊脂加5%綿羊血、肉湯、optochin紙片（5μg/片） 、苯唑西林、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、頭孢噻肟、氯霉素、氧氟沙星、萬古霉素藥敏紙片均購自英國OXOID公司。

1.3 細菌鑒定

將采集的標本接種于血平板，置于5%CO2，35℃過夜孵育18～24h。挑選菌落周圍有草綠色溶血環(huán)、細小、灰白色、表面光滑、扁平的可疑菌落，或中央塌陷、邊緣隆起、呈臍窩狀的可疑菌落，或表面光滑、濕潤有粘液的可疑菌落，進行革蘭染色、optochin試驗膽汁溶解試驗、菊糖發(fā)酵試驗，還可結(jié)合莢膜染色、觸酶試驗和其他生化反應(yīng)進行手工鑒定，也可利用VITEK-2全自動鑒定儀進行鑒定。質(zhì)控菌株ATCC49619跟隨整個過程。

1.4 藥敏試驗

用改良Kirby-Bauer法和微量肉湯稀釋法進行抗生素敏感性試驗，試驗操作及結(jié)果判讀按美國臨床試驗室國家標準化委員會（NCCLS）制訂的最新規(guī)則及標準進行。用1.5×108CFU/mL肺炎鏈球菌懸液接種于含5%羊血的MHA上，然后貼1μg/片的苯唑西林紙片，35℃溫育24h，如果抑菌環(huán)直徑≥20mm為青霉素敏感，＜20mm者，測定對青霉素的MIC值，如果MIC≤0.06μg/mL為敏感、0.12～1μg/mL為中度耐藥、≥2.0μg/mL為高度耐藥。結(jié)果判斷按照NCCLS2005年標準。質(zhì)控菌株ATCC49619跟隨整個過程。

1.5 統(tǒng)計分析

使用WHONET 5.3微生物實驗室數(shù)據(jù)管理軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié) 果

2.1 204株肺炎鏈球菌的耐藥率

自貢市第四人民醫(yī)院萬古霉素敏感率最高，無耐藥株，其他抗生素都有，見表1。

對四環(huán)素、紅霉素、克林霉素有較高的耐藥率，分別為83.3%、89.2%、90.2%。肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥情況：2006年7月至2007年6月、2007年7月至2008年6月、2008年7月至2009年6月青霉素對肺炎鏈球菌耐藥率分別為42.2% （27/64）、51.1% （45/88）、67.3%（35/52）。

表1 204株肺炎鏈球菌的耐藥率抗生素

2.2 PNSSP菌株的青霉素MIC值分布

2006年7月至2009年6月共檢出PNSSP菌株107株，其青霉素MIC值分布見表2，中介73株（68.2%），耐藥34株（31.8%）。2006年7月至2007年6月耐藥株占PNSSP的比率為22.2% （6/27），2007年7月至2008年6月比率為26.7% （12/45），2008年7月至2009年6月為45.7%（16/35）。每年P(guān)NSSP菌株呈上升趨勢，到2009年P(guān)NSSP的MIC值更是高達6μg/mL。

3 討 論

隨著對青霉素耐藥性的升高，肺炎鏈球菌對頭孢霉素、四環(huán)素和氯霉素的敏感性下降，抗生素耐藥菌株亦隨之增多。此外，對多種抗生素耐藥的肺炎鏈球菌均為耐青霉素株。據(jù)此我們認為，由于對青霉素耐藥株對其他多數(shù)抗生素亦不敏感，因此無論臨床還是實驗室都應(yīng)將肺炎鏈球菌的青霉素耐藥株與敏感株嚴格區(qū)分，以便針對用藥。

肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥機制是，青霉素結(jié)合蛋白（PBP）是β-內(nèi)酰胺類抗生素的作用靶點。肺炎鏈球菌對青霉素耐藥的機制主要是細菌細胞壁上的PBP基因發(fā)生變異，隨即高分子量PBP的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使其對抗生素分子的親和力降低而產(chǎn)生耐藥。通常單獨的PBP基因變異只會造成低耐藥菌株，而高水平耐藥通常是多個PBP聯(lián)合變異的結(jié)果。因為PRSP由PBP變異所致，所以或多或少涉及到頭孢菌素，這就是PRSP對頭孢菌素耐藥的根本原因。不同地區(qū)肺炎鏈球菌的耐藥性不一樣。自貢市第四人民醫(yī)院青霉素的耐藥率為52.5%，表明自貢地區(qū)肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥情況嚴重。統(tǒng)計自貢市第四人民醫(yī)院3年來肺炎鏈球菌對青霉素的耐藥率，2006年7月至2007年6月耐藥率為42.2%，2007年7月至2008年6月耐藥率51.1%，到2009年6月升至67.3%，呈上升趨勢。因此，抗生素的選擇通常以達到有效治療并盡可能少地誘導耐藥產(chǎn)生為原則，凡青霉素MIC≤2μg/mL的敏感和中介菌株感染仍可選擇高劑量青霉素G、阿莫西林、氨芐西林或頭孢菌素中的頭孢丙烯、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟以及頭孢泊肟等對肺炎鏈球菌有良好抗感染活性的口服二、三代頭孢菌素。2007年美國感染病學會/美國胸科學會（IDSA/ATS）在CAP指南中建議：高水平耐藥PRSP感染或存在耐藥高危因素的CAP患者，可選用呼吸氟喹諾酮類或β-內(nèi)酰胺類聯(lián)合大環(huán)內(nèi)酯類治療。我國肺炎鏈球菌對大環(huán)內(nèi)酯類耐藥率普遍在60%以上，且多呈高水平耐藥，因此在疑似肺炎鏈球菌所致CAP時不宜單用大環(huán)內(nèi)酯類治療。PNSSP菌株的青霉素MIC值分布特點：自貢市第四人民醫(yī)院PNSSP耐藥菌株比率增加，最大青霉素MIC值逐年增加，且菌株青霉素MIC值分布逐漸向較高數(shù)值范圍移動，顯示PNSSP對青霉素的耐藥性增強，呈上升趨勢。自貢市第四人民醫(yī)院分離的PNSSP以中介菌株為主，占72.9%。提示青霉素若加大劑量聯(lián)合用藥仍可作為經(jīng)驗治療并要對其進行耐藥性監(jiān)測。

本資料中，肺炎鏈球菌對紅霉素、四環(huán)素、克林霉素的耐藥率分為89.2%、83.3%、90.2%，表明大環(huán)內(nèi)酯類、克林霉素、四環(huán)素不適于肺炎鏈球菌感染。本資料顯示，氯霉素、氧氟沙星和萬古霉素對肺炎鏈球菌有較高的抗菌活性，尤其是萬古霉素未見耐藥株。但由于萬古霉素的不良反應(yīng)限制其在臨床的使用，氯霉素和氧氟沙星可作為青霉素不敏感菌株及青霉素過敏患者治療選用藥物，而且近年來有人認為喹諾酮類抗生素并不會對兒童軟骨發(fā)育造成損害[1]，隨著對這個問題的研究的深入和此類新藥的開發(fā)，它的應(yīng)用前景十分樂觀。

表2 2006年7月至2009年6月PNSSP菌株的青霉素MIC值分布

綜合以上分析，自貢市第四人民醫(yī)院肺炎鏈球菌耐藥情況較為嚴重，萬古霉素、氧氟沙星、氯霉素保持較好的抗菌活性，對頭孢噻肟還比較敏感，對紅霉素、四環(huán)素、克林霉素普遍耐藥。肺炎鏈球菌對抗菌藥物的耐藥狀況已非常嚴峻，必須嚴格規(guī)范抗菌藥物的使用和加強肺炎鏈球菌耐藥性和抗菌藥物使用情況的監(jiān)測，提高監(jiān)測范圍廣泛性和時間連續(xù)性，及時調(diào)整經(jīng)驗用藥方案和公共衛(wèi)生策略[2]，從而阻止細菌耐藥狀況的進一步惡化。

[1]李海永,邢莉.氟哌酸對兒童骨關(guān)節(jié)影響的臨床觀察[J].中國廠礦醫(yī)學,2003,16 (4):296.

[2]吳本權(quán),唐英春,朱家馨等.廣州市區(qū)兩幼兒園2～6歲健康兒童肺炎鏈球菌攜帶狀況調(diào)查[J].中國當代兒科雜志,2001,3(5): 529-531.