人肝腫瘤細(xì)胞系生物人工肝治療重型肝炎的臨床初步研究

劉鴻凌 游紹莉 榮義輝 王巖 劉婉姝 王業(yè)東 陳菊梅 辛紹杰

人工肝支持系統(tǒng)（artificial liver support system，ALSS）能提高重型肝炎/肝衰竭患者的救治成功率。由于生物型人工肝應(yīng)用了培養(yǎng)的肝細(xì)胞，不僅為肝衰竭患者代償肝臟的解毒、生物合成功能以及穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境、阻斷惡性循環(huán)提供了可能，而且為具有強(qiáng)大再生能力的肝組織再生提供了條件和時(shí)間。為了觀察生物人工肝治療重型肝炎的臨床療效，我們和美國(guó)Vital公司合作，應(yīng)用培養(yǎng)的人肝腫瘤細(xì)胞系細(xì)胞（C3A）建立體外肝臟支持系統(tǒng)（extracorporeal liver assist device，ELAD），并應(yīng)用該系統(tǒng)治療了5例重型肝炎患者，以初步評(píng)估其治療作用和安全性。

對(duì)象與方法

一、病人資料 2006年6月-2006年11月在我院住院的重型肝炎病人5例，均為男性，平均年齡42.4±6.19歲。診斷符合2000年全國(guó)病毒性肝炎和肝病會(huì)議制定的《病毒性肝炎防治方案》的標(biāo)準(zhǔn)[1]。治療前患者簽署知情同意書，試驗(yàn)方案經(jīng)解放軍302醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、生物人工肝支持系統(tǒng)的建立 治療前1～2周，將4×107C3A細(xì)胞（Vital公司，美國(guó)）分別接種在4個(gè)中空纖維反應(yīng)器（Vital公司，美國(guó)）內(nèi)，進(jìn)行循環(huán)培養(yǎng)，采用MEM培養(yǎng)液，其中添加10%胎牛血清（GIBCO產(chǎn)品，美國(guó)），流速約200ml/min，每24h換液一次，至使用時(shí)，中空纖維反應(yīng)器中C3A細(xì)胞共約400g。進(jìn)行人工肝治療前，將含有C3A細(xì)胞（約4×109）的中空纖維反應(yīng)器、加熱器、增氧器、電腦數(shù)據(jù)記錄裝置、肝素泵、葡萄糖泵、電解質(zhì)監(jiān)護(hù)儀、超濾液發(fā)生器（Cas－cadenflo EC，日本）等組成生物人工肝支持系統(tǒng)。使用前使用4000ml生理鹽水對(duì)整個(gè)支持系統(tǒng)進(jìn)行沖洗。

三、生物人工肝治療 選擇頸內(nèi)靜脈穿刺，放置大孔徑雙腔管，建立血液循環(huán)通道。在肝素抗凝條件下，在人工肝支持系統(tǒng)（KM8900，日本）上行持續(xù)緩慢的血漿透析濾過（continuous hematoplasma dialysis filtration，CHDF）和血漿置換治療，置換血漿量約為2000ml～3000ml。血液流速為 100ml/min，血漿流速為10ml/min，置換液流速為2L/h，治療時(shí)間為5～6小時(shí)。次日，檢查人工肝支持裝置，將頸內(nèi)靜脈置管與生物型人工肝支持系統(tǒng)連接，連續(xù)72h治療。在治療過程中，常規(guī)進(jìn)行內(nèi)科綜合治療。

四、生化指標(biāo)等的檢測(cè) 采用日本OLYMPUS全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血生化指標(biāo)；采用ELECTRA法檢測(cè)血氨（VITROS，美國(guó)）；采用美國(guó)Lexington試劑盒檢測(cè)凝血酶原活動(dòng)度（PTA）；采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)甲胎蛋白（AFP，北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司）。

結(jié)果

一、不良反應(yīng) 3例患者在治療2h時(shí)出現(xiàn)寒戰(zhàn)，經(jīng)對(duì)癥處理后緩解，未發(fā)熱，無皮疹和血壓下降等反應(yīng)。

二、治療效果 在5例患者中，3例經(jīng)住院治療2月后臨床痊愈，1例好轉(zhuǎn)，1例在治療結(jié)束5天后因肝性腦病死亡（表1）。

表1 5例患者的一般情況

三、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo) 見表2。

表2 5例患者在生物人工肝治療前后血生化指標(biāo)（±s）的變化

表2 5例患者在生物人工肝治療前后血生化指標(biāo)（±s）的變化

與治療前比，①P＜0.05；②P＜0.01

CHDF 治療前生物人工肝TBIL（μmol/L） NH3（μmol/L） PTA（%） ALB（g/L） AFP（ng/ml）308.8±118.1 75.6±20.5 43.3±1.8 31.8±3.4 158.4±99.7212.0±74.8 60.6±22.8 61.9±8.6 31.8±1.6145.3±88.7① 43±11.8 16.3±16.6① 31.2±7.7治療結(jié)束2周 98.5±20① 69.6±44.6 41.4±20.4 35.7±4.7 903.7±66.3②治療結(jié)束8周 23.4±6.0② 25.7±12.5 57.4±12.1 35±1.0 95.1±58.0②治療前治療后

討 論

慢性重型肝炎/肝衰竭患者的最終恢復(fù)有賴于肝細(xì)胞的再生。近年研究顯示，以培養(yǎng)肝細(xì)胞為生物材料的生物人工肝系統(tǒng)可為肝衰竭患者提供過渡支持治療，為肝移植或等待肝再生恢復(fù)功能而爭(zhēng)取時(shí)間，但目前在國(guó)內(nèi)尚無長(zhǎng)時(shí)間生物人工肝支持治療重型肝炎的研究報(bào)道[2～6]。

應(yīng)用于生物人工肝的細(xì)胞主要有腫瘤來源的C3A細(xì)胞株、病毒轉(zhuǎn)染的HepZ肝細(xì)胞株和可恢復(fù)的NKNT-3肝細(xì)胞株。C3A細(xì)胞株分化較好、具有較完全的正常肝細(xì)胞功能，而且可以永生化，實(shí)驗(yàn)證實(shí)它具有很多正常肝細(xì)胞的功能，如合成白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、纖維酶原、銅蘭蛋白、補(bǔ)體C4和甲胎蛋白等。此外，該細(xì)胞還具有很多接近正常人肝細(xì)胞水平的重要代謝功能，如糖原異生、尿素合成、半乳糖和利多卡因的代謝等[7～12]。

本研究在血漿置換和透析后進(jìn)行生物人工肝治療5例早、中期重型肝炎患者，取得了較好的效果?；颊哐蹇偰懠t素下降，消化道癥狀減輕，PTA增加，肝性腦病改善，3例患者臨床痊愈出院，至今患者仍健康，未發(fā)生肝臟或其它部位腫瘤。

[1]中華醫(yī)學(xué)會(huì)傳染病與寄生蟲病學(xué)分會(huì)和肝病學(xué)分會(huì).病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志，2000，8（6）：324-329.

[2]NYBERG SL，HAY EJ，RAMIN KD，et al.Successful pregnancy after porcine bioartificial liver treatment and liver transplantation for fulminant hepatic failure[J].Liver Transpl，2002，8（2）:169-170.

[3]GERLACH JC，ZEILINGER K，SAUER IM，et al.Extracorporeal liver support:porcine or human cell based systems[J].Int J Artif Organs，2002，25（10）:1013-1018.

[4]VILEI MT，GRANATO A，F(xiàn)ERRARESSO C，et al.Comparison of pig，human and rat hepatocytes as a source of liver specific metabolic functions in culture systems:implication for use in bioartificial liver devices[J].Int J Artif Organs，2001，24（6）:392-396.

[5]KOBAYASHI N，MIYAZAKI M，F(xiàn)UKAYA K,et al.Establishment of a highly differentiate immortalized human hepatocytes cell line as a source of function in the bioartificial liver[J].Transplant Proc，2000，32:237-241.

[6]BROTHERTON J.美國(guó)C3A細(xì)胞支持的生物人工肝研究進(jìn)展[J]. 實(shí)用肝臟病雜志，2005，8（5）:320.

[7]林世德，羅亞文，蘇毅，等.重型肝炎研究進(jìn)展[J].實(shí)用肝臟病雜志，2009，2（1）:73-75.

[8]KOBAYASHI N.Life support of artificial liver:development of a bioartifcial liver to treat liver failure[J].J Hepatobiliary Pancreat Int，2009，16:113-117.

[9]ANTONINO S，VERONIQUE SB，PHILIPPER M，et al.What clinical alternatives to whole liver transplantation CurrentStatus ofArtificialDevices and Hepatocyte Transplantation[J].Transplantation，2009，87（4）27:457-465.

[10]SCHREM H，KLEINE M，BORLAK J，et al.Physiological incompatibilities of porcine hepatocytes for clinical liver support[J].Liver Transpl，2006，12:1832-1840.

[11]PHUA J，LEE KH.Liver support devices[J].Curr Opinion Crit Care，2008，14:208-215.

[12]CHAMULEAU RA，DEURHOLTT，HOEKSTRA R.Which are the right cells to be used in a bioartificial liver[J].Metab Brain Dis，2005，20（4）:327-335.