長托寧對(duì)癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用研究

霍 瑩,鄭輯英,李光來,薛國芳,牛海雁

癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)是神經(jīng)科的急癥,臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都證實(shí),SE會(huì)導(dǎo)致認(rèn)知、行為的改變,嚴(yán)重時(shí)會(huì)直接導(dǎo)致死亡。研究表明,SE后引起的細(xì)胞凋亡是癇性腦損傷的重要環(huán)節(jié)之一。因此,抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生,對(duì)防治SE導(dǎo)致的腦組織損傷具有重要的臨床意義。長托寧是一種新型的腦保護(hù)劑,有報(bào)道顯示[1],長托寧可以減輕缺血/再灌注時(shí)腦組織損傷,起到腦保護(hù)作用。但長托寧對(duì)SE導(dǎo)致的腦損傷是否有保護(hù)作用尚未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在觀察SE后大鼠腦組織凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2的表達(dá)情況,探討長托寧干預(yù)對(duì)SE導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷的影響及其可能機(jī)制,以期為長托寧應(yīng)用于臨床SE的治療提供可能的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雄性Wistar大鼠54只,體重180 g～220 g,由山西醫(yī)科大學(xué)生理教研室動(dòng)物中心提供;氯化鋰購自中國醫(yī)藥集團(tuán)上海試劑公司;匹羅卡品購自美國Sigma公司;兔抗鼠Bcl-2多克隆抗體、兔抗鼠Caspase-3多克隆抗體、TUNEL試劑盒、即用型SABC試劑盒均系武漢博士德公司產(chǎn)品;DAB試劑由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司出品;長托寧系成都力思特制藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 54只Wistar大鼠隨機(jī)分為A組(對(duì)照組)6只,B組(模型組)和C組(長托寧組)各24只,后兩組按時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組(6 h,12 h,24 h,48 h)。

1.2.2 動(dòng)物模型制備 C組在造模前15 min腹腔注射長托寧2 mg/kg,24 h和 48 h亞組每12 h重復(fù)1次,劑量同前。A組、B組于相對(duì)應(yīng)時(shí)間給予等量生理鹽水。15 min后B組、C組腹腔注射氯化鋰127 mg/kg,18 h后再注射新鮮配制的匹羅卡品30 mg/kg制備SE模型;A組腹腔注射等量的生理鹽水。觀察大鼠出現(xiàn)癇性發(fā)作的時(shí)間和表現(xiàn),使之持續(xù)1 h,然后腹腔注射地西泮10 mg/kg以終止癇性發(fā)作。驚厥評(píng)分采用Racine評(píng)分法,出現(xiàn)3級(jí)以上發(fā)作提示造模成功,造模過程中大鼠出現(xiàn)死亡或不符合模型要求者,予以剔除并隨機(jī)補(bǔ)充,以保證每組動(dòng)物6只。

1.2.3 標(biāo)本處理 在SE后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)各取大鼠6只,用25%烏拉坦4 mL/kg深麻醉后,斷頭取腦,大鼠腦組織置入4%多聚甲醛中固定,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋后,在視交叉后海馬區(qū)連續(xù)冠狀切片,片厚 5 μ m,每隔15張連續(xù)取 4張,相鄰切片分為四套,分別進(jìn)行各指標(biāo)的檢測。HE染色,光鏡下觀察形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4 細(xì)胞凋亡檢測 采用T UNEL法檢測,按試劑盒(POD)提供的方法進(jìn)行操作,細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者即為陽性細(xì)胞,即凋亡細(xì)胞。

1.2.5 Caspase-3及Bcl-2蛋白免疫組化檢測 免疫組化步驟參照試劑盒推薦方法進(jìn)行(常規(guī)SABC法,DAB染色)。胞漿或核膜染色呈棕黃色為蛋白陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,兩組間的比較采用t檢驗(yàn),多組間的比較采用方差分析,檢測結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。

2 結(jié) 果

2.1 行為學(xué)表現(xiàn) B組大鼠注射匹羅卡品后15 min～30 min均出現(xiàn)流涎、點(diǎn)頭、洗臉樣動(dòng)作;隨后出現(xiàn)前肢陣攣,之后很快表現(xiàn)為前肢陣攣伴站立,進(jìn)一步發(fā)展到全身強(qiáng)直陣攣發(fā)作伴站立、摔倒,反復(fù)發(fā)作,均達(dá)到Ⅳ級(jí)～Ⅴ級(jí)發(fā)作,呈癲癇持續(xù)狀態(tài),點(diǎn)燃率為100%;C組大鼠也均達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài),但潛伏期較長且癇性發(fā)作程度較B組輕,多在Ⅲ級(jí)～ Ⅳ級(jí)發(fā)作;A組大鼠無癲癇發(fā)作。

2.2 HE染色結(jié)果 A組神經(jīng)元排列整齊緊密,胞漿透明,細(xì)胞核呈圓形或橢圓形,染色質(zhì)分布均勻,核仁清晰;B組出現(xiàn)了嗜酸性神經(jīng)元,表現(xiàn)為細(xì)胞排列紊亂,胞體收縮呈三角形或極不規(guī)則,胞漿紅染、胞核明顯固縮;C組也出現(xiàn)嗜酸性神經(jīng)元,但排列尚整齊,形態(tài)接近正常。

2.3 細(xì)胞凋亡檢測 A組僅有少量TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá),呈散在分布,著色較淺;B組6 h時(shí)TUNEL陽性細(xì)胞表達(dá)開始增多,并隨時(shí)間點(diǎn)的延長而增加,24 h達(dá)高峰,48 h減少,與B組相比,C組TUNEL陽性細(xì)胞仍在24 h達(dá)高峰,但相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)均低于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(除6 h外,P＜0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠海馬T UNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)個(gè)

表1 各組大鼠海馬T UNEL陽性細(xì)胞數(shù)比較(±s)個(gè)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h A組 2.09±0.33 B組 14.71±1.431) 28.33±1.731)36.16±1.831) 27.46±1.451)C組 13.38±1.41 18.53±1.292)27.58±1.422) 19.41±1.392)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05

2.4 Bcl-2和Caspase-3蛋白的表達(dá) A組可有Bcl-2、Caspase-3微量的基礎(chǔ)表達(dá);B組與 A組比較,6 h時(shí) Bcl-2和Caspase-3表達(dá)開始增強(qiáng)(P＜0.05),12h時(shí),Bcl-2達(dá)高峰(P＜0.05),Caspase-3顯著增強(qiáng)(P＜0.05);24 h Bcl-2開始減弱(P＜0.05),Caspase-3達(dá)峰值(P＜0.05),48 h二者均繼續(xù)減弱(P＜0.05)。C組與B組比較,除 6 h外,各時(shí)點(diǎn) Bcl-2和Caspase-3表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。詳見表 2、表3。

表2 各組大鼠海馬Bcl-2免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)(±s)個(gè)

表2 各組大鼠海馬Bcl-2免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)(±s)個(gè)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h A 組 10.35±1.08 B組 25.34±1.251) 39.94±1.751)33.09±2.051) 25.69±1.501)C組 26.56±1.49 50.18±1.742)46.46±2.832) 41.56±1.392)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05

表3 各組大鼠海馬Caspase-3免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)(±s)個(gè)

表3 各組大鼠海馬Caspase-3免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)(±s)個(gè)

組別 6 h 12 h 24 h 48 h A組 1.70±0.29 B組 10.23±1.491) 18.45±1.501)30.87±2.501) 24.27±1.841)C組 9.44±1.35 12.33±1.402)18.42±1.592) 15.67±1.392)與A組比較,1)P＜0.05;與B組比較,2)P＜0.05

3 討 論

SE后神經(jīng)元的損傷機(jī)制一直是近年來的研究熱點(diǎn),形態(tài)學(xué)和生化的方法均證實(shí),SE后神經(jīng)元死亡具有典型的凋亡特征。Bcl-2和Caspases蛋白家族是最主要的凋亡調(diào)控基因。Bcl-2是第一個(gè)被認(rèn)為可以抑制細(xì)胞凋亡的基因,它可以阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生,延長細(xì)胞生存,被稱為細(xì)胞長壽基因[2]。氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)SE后Bcl-2表達(dá)異常,證實(shí)Bcl-2參與了SE后神經(jīng)元損傷的調(diào)控[3]。隨著對(duì)凋亡研究的深入,Caspase-3越來越引起人們的關(guān)注。細(xì)胞凋亡過程實(shí)際上是Caspase不可逆有限水解底物的級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)過程,Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中下游最關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行蛋白酶,在凋亡程序中起最后樞紐作用[4]。有研究發(fā)現(xiàn)[5],6周齡的SD大鼠,在腹腔注射匹羅卡品出現(xiàn)SE后1 h處死,免疫陽性Caspase-3陡然升高(與對(duì)照組相比),證實(shí)Caspase-3在癲癇引起的神經(jīng)元凋亡機(jī)制中確實(shí)發(fā)揮了重要的作用。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示,A組僅有Bcl-2、Caspase-3基礎(chǔ)量的表達(dá),B組Bcl-2于SE后6h升高,12 h達(dá)高峰,48 h減少;而Caspase-3在SE后6 h升高,24 h達(dá)峰值,這與TUNEL陽性細(xì)胞的表達(dá)基本一致,進(jìn)一步證明Bcl-2抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡,而Caspase-3促進(jìn)細(xì)胞凋亡。C組各時(shí)間點(diǎn)TUNEL、Caspase-3陽性細(xì)胞較B組減少(除6 h外均 P＜0.05),而Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)增加(除 6 h外均 P＜0.05),表明長托寧能夠通過上調(diào) Bcl-2、下調(diào)Caspase-3,從而產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用。

近年來,抗膽堿能藥物作為一種新型的腦保護(hù)劑越來越得到人們的關(guān)注。有研究表明[6],抗膽堿能藥物可以通過穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗氧自由基損傷、減少鈣超載、抑制興奮性氨基酸釋放、抑制一氧化氮(NO)釋放、促進(jìn)熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)等方式,從而發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。長托寧(鹽酸戊乙奎醚注射液)是一種新型的抗膽堿藥物,具有抗膽堿作用強(qiáng)而全面,副反應(yīng)少,半衰期長,易通過血腦屏障的特點(diǎn),臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均證實(shí)長托寧具有較強(qiáng)的腦細(xì)胞保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明,預(yù)先給予長托寧能延遲SE出現(xiàn)的時(shí)間,并減輕癲癇發(fā)作級(jí)別以及神經(jīng)元的損傷程度,長托寧可能通過上調(diào)SE時(shí)大鼠腦組織Bcl-2的表達(dá)和抑制Caspase-3產(chǎn)生,從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。長托寧的腦保護(hù)機(jī)制是多途徑、多位點(diǎn)的,筆者將做進(jìn)一步探討。

[1]曹鋒生,韓繼媛,田兆興.長托寧對(duì)大鼠急性全腦缺血再灌注后NF-κ B的影響[J].嶺南急診醫(yī)學(xué)雜志,2006,11(1):7-9.

[2]Konturek PC,Konturek SJ,Sulekova Z,et al.Expression of hepatocyte growth factor,transforming growth fact or alpha,apoptosis related proteins bax and bcl-2,and gastrin in human gastric cancer[J].Aliment Pharma col T her,2001,15:989-999.

[3]岳宏,鄭輯英、李光來,等.塞來昔布對(duì)大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)海馬神經(jīng)元凋亡及Bcl-2表達(dá)的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2008,6(4):436-438.

[4]Zhu C,Wang X,Xu F,et al.The influence of age on apoptotic and other mechanisms of cell death after cerebral hypoxia-ischemia[J].Cell Death Differ,2005:12(2):162-176.

[5]溫曉妮.促紅細(xì)胞生成素預(yù)處理對(duì)鋰-匹羅卡品誘導(dǎo)的癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的影響[J].陜西醫(yī)學(xué)雜志,2008,8(37):954-956.

[6]曹鋒生,韓繼媛.抗膽堿能藥防治缺血再灌注損傷的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2006,25(9):931-933.