大鼠腦缺血再灌注后腦組織CD40L、MMP-3的表達(dá)1)

田永青,李東芳,李光來,解學(xué)軍,冀俊林

CD40與CD40L結(jié)合后可誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)等的表達(dá)[1]。然而MMP-3可降解細(xì)胞外基質(zhì),改變血管通透性,參與血管源性腦水腫。本實(shí)驗(yàn)通過分析大鼠腦缺血再灌注后腦組織CD40L、MMP-3、神經(jīng)功能評(píng)分與腦含水量的變化特點(diǎn),進(jìn)一步探討CD40L、M MP-3參與腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑及設(shè)備 雄性Wistar大鼠48只,體重250 g～350 g,購于山西醫(yī)科大學(xué)生理實(shí)驗(yàn)室。將其分為假手術(shù)組(sham)、缺血再灌注組(IR組,分為 6 h、24 h、48 h、72 h、7 d亞組)。CD40L、MM P-3抗體:北京博奧森生物技術(shù)有限公司;SABC染色試劑盒、DAB顯示試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司。BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)軟件(成都泰盟科技有限公司)。

1.2 動(dòng)物模型制作方法 參照Zealonga的改良線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈栓死模型(MCAO)。基本步驟:大鼠于術(shù)前夜禁食;稱重后,用10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔麻醉;備皮,消毒并于頸部行25 mm縱向切口,分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)及頸外動(dòng)脈(ECA);結(jié)扎ECA與CCA;于ECA與 ICA分叉下方剪一切口,將一預(yù)先處理過的漁線插入CCA,經(jīng)ICA入顱直到有輕微阻力感為止,插入深度為(20.0±0.5)mm,實(shí)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈阻塞。結(jié)扎入口處,漁線外留1 cm,消毒,全層縫合傷口。2 h后提拉線頭至CCA,實(shí)現(xiàn)對(duì)缺血腦組織再灌注,造模完成。

1.3 取材和指標(biāo)的檢測(cè) 大鼠腦再灌注后,用10%水合氯醛麻醉,開胸暴露心臟,經(jīng)升主動(dòng)脈插管剪開左心耳,用生理鹽水250 mL快速?zèng)_洗,取腦,切右側(cè)半腦在4%多聚甲醛中固定6 h。用免疫組化檢測(cè)腦組織CD40L、MMP-3。每只大鼠各個(gè)指標(biāo)做一張切片,每張隨機(jī)取5個(gè)視野,計(jì)算CD40L、MMP-3的陽性細(xì)胞數(shù)并進(jìn)行光密度值測(cè)定。取平均值作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)。

1.4 神經(jīng)功能評(píng)分 用Longa神經(jīng)功能評(píng)分法評(píng)分。0分:無神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:輕微神經(jīng)功能缺損,不能完全伸展左側(cè)前爪;2分:中度局灶性神經(jīng)功能缺損,向左側(cè)轉(zhuǎn)圈;3分:重度局灶性神經(jīng)功能缺損,向左側(cè)傾倒;4分:不能自發(fā)行走或意識(shí)喪失。1分～3分為有效模型。

1.5 腦組織含水量測(cè)定 用干濕重法。取腦后在電子天平上稱得其濕重,然后取左側(cè)半腦即刻置于烤箱,100℃恒溫烘烤24 h至恒重,稱干重并計(jì)算含水量。腦含水量=(濕重-干重×2)/濕重×100%。

2 結(jié) 果

2.1 再灌注后CD4OL的表達(dá) 再灌注6 h已有CD40L的表達(dá),24 h、48 h陽性細(xì)胞數(shù)和光密度值達(dá)到高峰,72 h后開始降低,7 d仍有表達(dá),達(dá)到一比較穩(wěn)定低值。詳見表1。

表1 各組大鼠腦組織CD40L表達(dá)(±s)

表1 各組大鼠腦組織CD40L表達(dá)(±s)

組別 n 陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/切片)光密度值sham組 8 0 0 IR組 6 h 8 7.13±2.701) 0.223±0.0091)24 h 8 21.25±7.131)2) 0.310±0.0121)2)48 h 8 28.25±8.081)2)3) 0.383±0.0161)2)3)72 h 8 18.63±4.751)4) 0.345±0.0171)4)7 d 8 5.13±2.234)5) 0.213±0.0134)5)與sham組比較,1)P＜0.01;與6 h組比較,2)P＜0.01;與24 h組比較,3)P＜0.05;與 48 h組比較,4)P＜0.05;與 72 h組比較,5)P＜0.01

2.2 再灌注后MM P-3的表達(dá) 再灌注6 h已有M MP-3的表達(dá),24 h,48 h陽性細(xì)胞數(shù)與光密度值達(dá)到高峰。詳見表2。

表2 各組大鼠腦組織MMP-3表達(dá)(±s)

表2 各組大鼠腦組織MMP-3表達(dá)(±s)

組別 n 陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)/切片)光密度值sham組 8 0 0 IR組 6 h 8 5.88±2.231) 0.236±0.0091)24 h 8 19.25±7.381)2) 0.356±0.0111)2)48 h 8 24.88±6.561)2)3) 0.482±0.0151)2)3)72 h 8 16.59±5.271)4) 0.423±0.0081)4)7 d 8 4.88±2.104)5) 0.230±0.0104)5)與sham組比較,1)P＜0.01;與6 h組比較,2)P＜0.01;與24 h組比較,3)P＜0.05;與 48 h組比較,4)P＜0.05;與 72 h組比較,5)P＜0.01

2.3 再灌注后神經(jīng)功能評(píng)分(見表3)

表3 各組大鼠再灌注不同時(shí)間點(diǎn)Longa評(píng)分(±s)

表3 各組大鼠再灌注不同時(shí)間點(diǎn)Longa評(píng)分(±s)

組別 n 神經(jīng)功能評(píng)分秩次sham組 8 5.38±3.89 IR組 6 h 8 22.50±8.021)24 h 8 34.63±10.211)2)48 h 8 38.13±6.731)2)3)72 h 8 27.63±11.761)4)7 d 8 18.75±6.944)5)與sham組比較,1)P＜0.01;與6 h組比較,2)P＜0.01;與24 h組比較,3)P＜0.05;與 48 h組比較,4)P＜0.05;與 72 h組比較,5)P＜0.01

2.4 再灌注后腦含水量(見表4)

表4 各組大鼠再灌注后腦含水量(±s)

表4 各組大鼠再灌注后腦含水量(±s)

組別 n 腦含水量(%)sham組 8 75.63±1.20 IR組 6 h 8 78.11±1.221)24 h 8 80.73±1.191)2)48 h 8 82.39±1.071)2)3)72 h 8 79.24±1.341)4)7 d 8 77.06±1.174)5)與sham組比較,1)P＜0.01;與6 h組比較,2)P＜0.01;與24 h組比較,3)P＜0.05;與48 h組比較,4)P＜0.05;與 72 h組比較,5)P＜0.01

3 討 論

CD40屬于 TNF-γ受體家族,主要表達(dá)于單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞也能表達(dá)[2]。CD40L是TNF超家族成員,主要表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞,巨噬細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞也能表達(dá)[3]。目前CD40/CD40L參與腦缺血再灌注損傷的研究大多源自動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。Ishikawa等[3]發(fā)現(xiàn)敲除CD40或CD40L基因的小鼠MCAO模型,其大腦的梗死體積較對(duì)照組減少30%～40%,表明在腦缺血再灌注損傷過程中CD40/CD40L信號(hào)系統(tǒng)起重要作用。近年來研究的有關(guān)卒中患者的CD40L主要是血清sCD40L,其中95%由血小板分泌而非來自腦組織,且血清sCD40L在體外不能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng),而重組的sCD40L卻能;可知sCD40L在腦缺血病理生理過程中的作用并不肯定。MM P-3為鋅離子依賴性內(nèi)肽酶,已證實(shí)MMP-3單倍體可以預(yù)測(cè)腦卒中[4],而最近研究發(fā)現(xiàn)MM P-3和MMP-9可能會(huì)導(dǎo)致血管源性腦水腫[5]。顯然以上研究的CD40L和MMP-3都來源于血清且作用機(jī)制并不十分明確,而腦組織中的CD40L和MM P-3目前還研究尚少。

本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)缺血再灌注6 h后腦組織有CD40L與MMP-3的表達(dá),24h～48h陽性細(xì)胞數(shù)與CD 40L和MMP-3的表達(dá)強(qiáng)度均達(dá)高峰,72 h后開始下降,7 d仍有較低表達(dá),與腦含水量、神經(jīng)功能評(píng)分變化特點(diǎn)基本一致。證實(shí)腦組織中CD40L、MM P-3與腦缺血再灌注損傷密切相關(guān),可能為以下機(jī)制:缺血再灌注后腦組織CD40L表達(dá)增高,誘導(dǎo)M MP-3分泌,MM P-3可以通過降解各型蛋白及膠原來參與血腦屏障的損傷;MM P-3還可激活MM P-9,共同參與血腦屏障的損傷。白細(xì)胞通過受損的血腦屏障滲入腦組織,并分泌相關(guān)炎性介質(zhì)促進(jìn)炎癥,加重腦水腫,造成缺血腦組織的損傷。然而CD40L的作用并不局限于此,其信號(hào)通路可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞因子、黏附分子、趨化因子等參與腦缺血再灌注損傷。

綜合分析CD40L在腦缺血再灌注損傷的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處在上游,如果能及時(shí)有效的阻斷CD40/CD40L通路,將能極大減少再灌注損傷。如何能找到特效的通路阻滯劑仍是今后研究的重點(diǎn)。

[1]Mach F,Schonbeck U,Fabunmi RP,et al.T lymphocytes induce endothelial cell matrix metalloproteinase expression by a CD40L dependent mechanism implications for tubule formation[J].Am J Pathol,1999,154:229-238.

[2]Geldart T,Illidge T.Anti-CD40 monoclonal antibody[J].Leuk Ly mphoma,2005,46:1105-1113.

[3]Ishikawa M,Vowinkel T,Stokes KY,et al.CD40/CD40 ligand signaling in mouse cerebral microvasculature after focal ischemia/reperfusion[J].Circulation,2005,111:1690-1696.

[4]Kaplan RC,Smith NL.Matrix metalloproteinase-3(MMP3)and MMP9 genes and risk of my ocardial infarction,ischemic stroke,and hemorrhagic stroke[J].Atherosclerosis,2008,201(1):130-137.

[5]楊虹,魏桂榮,李紅戈.腦梗死血清 MMP-3與M MP-9的動(dòng)態(tài)變化及臨床意義[J].中國康復(fù),2005,20(5):278-280.