益氣活血復(fù)方對內(nèi)皮細胞TLR4及其下游MyD1)88、TRAF-6、TRAM 、TRIF mRNA 表達的影響

姜 華,張 艷,王 辰

動脈粥樣硬化(AS)是心腦血管病的基礎(chǔ),形成原因復(fù)雜,炎性因子是其主要因素[1]。近年研究表明 Toll樣受體 4(T LR4)作為介導(dǎo)先天免疫和炎癥反應(yīng)的主要受體,參與動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展。TLR4激動后通過轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B產(chǎn)生炎性細胞因子,介導(dǎo)了脂多糖(LPS)誘導(dǎo)動脈內(nèi)皮細胞黏附分子及細胞因子的表達[2]。本實驗研究益氣活血復(fù)方含藥血清對LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞TLR4及髓樣分化因子88(MyD88)依賴途徑和MyD88非依賴途徑的影響,探討益氣活血復(fù)方含藥血清防治AS的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 益氣活血復(fù)方由黃芪、人參、茯苓、紅花、丹參、川芎和當歸組成,水煎3次,時間分別為1.5 h、1 h和45 min,合并煎煮液后過濾濃縮至高(含生藥 1.6 g/mL)、中(含生藥0.8 g/mL)、低(含生藥0.4 g/mL)濃度。阿托伐他汀純品由LKT Laboratories提供。

1.2 試劑 LPS購自Sigma公司;RNA-OUT總RNA提取試劑盒購于北京天來生物醫(yī)學(xué)科技責任公司;M-M LV反轉(zhuǎn)錄酶為Promega產(chǎn)品。

1.3 動物 雄性新西蘭大耳白兔20只,體重2.5 kg±0.5 kg,由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)及鑒定 無菌條件下取產(chǎn)后新鮮臍帶,用PBS沖洗后,加入預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶,置于37℃水浴中消化10 min,收集消化液,1 000 r/min離心10 min。棄掉上清,加入DM EM 培養(yǎng)液(含20%胎牛血清),置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合狀態(tài),再用0.25%胰蛋白酶消化傳代。培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞符合內(nèi)皮細胞特征,抗人Ⅷ因子抗體染色陽性。采用培養(yǎng)的第2～4代內(nèi)皮細胞,待細胞生長融合成單層后用于實驗。

1.4.2 含藥血清的制備 20只新西蘭白兔隨機分為正常組、中藥高濃度組、中藥中濃度組、中藥低濃度組,每組5只。高、中、低濃度組分別以高(13.2 g/kg)、中(6.6 g/kg)、低(3.3 g/kg)濃度益氣活血復(fù)方灌胃。正常組以同等量的生理鹽水灌胃,連續(xù)7 d。末次灌胃給藥2 h后心臟采血,離心后分離血清,合并同組含藥血清,0.22 μ m微孔濾膜過濾后,-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 分組及干預(yù) 將HUVECs細胞懸液以1×106/L濃度接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中,以含10%FBS的DM EM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h,待細胞生長融合成單層后,分為6組:空白對照組、模型組、西藥對照組、中藥高濃度組、中藥中濃度組、中藥低濃度組。各組分別以下列方法干預(yù),空白對照組含10%空白藥物血清的DMEM培養(yǎng)液;模型組含10%空白藥物血清的DMEM培養(yǎng)液+LPS(1 μ g/mL);西藥對照組含10%空白藥物血清的 DMEM培養(yǎng)液+LPS(1 μ g/mL)+阿托伐他汀(10μ mol/L);中藥高濃度組含10%高濃度藥物血清的DMEM 培養(yǎng)液+LPS(1 μ g/mL);中藥中濃度組含10%中濃度藥物血清的DMEM培養(yǎng)液+LPS(1 μ g/mL);中藥低濃度組含10%低濃度藥物血清的 DMEM 培養(yǎng)液+LPS(1 μ g/mL)。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞。

1.4.4 熒光定量PCR 用RNA-OUT提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄,熒光定量PCR測定 TLR4、M yD88、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(TRAF-6)、Toll樣受體相關(guān)的干擾素活化分子(TRIF)及Toll樣受體相關(guān)分子(TRAM)mRNA的表達。PCR反應(yīng)條件,擴增條件:94℃變性 5 min×55個循環(huán),72℃延伸 5 min。本實驗設(shè)定GAPDH為內(nèi)參照做平型管。引物從Gene Bank獲得,使用Prime 5.0軟件設(shè)計,由大連寶生物工程有限公司合成。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(±s)表示,組間比較采用方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞TLR4、MyD88及T RAF-6mRNA表達的影響(見表1)用LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞后,模型組細胞TLR4及下游MyD88依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件MyD88和TRAF-6 mRNA表達明顯升高(P＜0.01);經(jīng)藥物干預(yù)后各治療組細胞T LR4及 MyD88、TRAF-6 mRNA明顯下降,中藥高濃度組在3個濃度組當中效果最好(P＜0.01);而中濃度組和低濃度組的效果低于高濃度組(P＜0.05)。

表1 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞TL R4 MyD88及TRAF-6 mRNA的影響(±s)

表1 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞TL R4 MyD88及TRAF-6 mRNA的影響(±s)

組別 n TLR4 MyD88 TRAF-6空白對照組 5 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 5 3.08±0.291) 3.74±0.471) 3.83±0.711)西藥對照組 5 1.70±0.321)2) 2.15±0.411)2) 2.22±0.581)2)中藥高濃度組 5 2.11±0.451)2) 2.37±0.461)2) 2.68±0.901)2)中藥中濃度組 5 2.44±0.441)3) 2.85±0.661)3) 2.92±0.551)3)中藥低濃度組 5 2.54±0.451)3) 3.03±0.681)3) 3.40±0.541)與空白對照組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.01;與中藥高濃度組比較,3)P＜0.05

2.2 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞TRAM及TRIF mRNA表達的影響(見表2)用 LPS刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞后,模型組細胞MyD88非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要元件TRAM及TRIF mRNA表達明顯升高(P＜0.01);經(jīng)藥物干預(yù)后3個中藥治療組抑制效果不明顯,無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞 TRAM及T RIF mRNA的影響(±s)

表2 對人臍靜脈內(nèi)皮細胞 TRAM及T RIF mRNA的影響(±s)

組別 n TRAM T RIF空白對照組 5 1.00±0.00 1.00±0.00模型組 5 2.96±0.571) 2.97±0.691)西藥對照組 5 2.01±0.701)2) 2.14±0.661)2)中藥高濃度組 5 2.41±0.591) 2.57±0.571)中藥中濃度組 5 2.59±0.551) 2.61±0.661)中藥低濃度組 5 2.76±0.541) 2.66±0.601)與空白對照組比較,1)P＜0.01;與模型組比較,2)P＜0.05

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種多因素共同參與的慢性炎癥性疾病,內(nèi)皮細胞損傷、炎癥機制在動脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展中起著極為重要的作用,免疫系統(tǒng)的活化貫穿于動脈粥樣硬化的始終[3]。TLR4是介導(dǎo)先天免疫和炎癥反應(yīng)的跨膜受體,它的主要功能是作為LPS的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。研究發(fā)現(xiàn)C3H/HeJ小鼠的TLR4胞內(nèi)區(qū)帶有一個基因點突變,使得TLR4的功能消失,對LPS低應(yīng)答。而這種TLR4基因點突變的C3H/HeJ小鼠,高膽固醇飲食不能促進動脈粥樣硬化斑塊形成。在動脈粥樣硬化小鼠模型中用TLR4的配體刺激后,斑塊的面積明顯增加了,這提示TLR4的激活促進了斑塊的形成。在大鼠動物模型中,TLR4激動可刺激動脈粥樣硬化斑塊的形成和血管外膜的重構(gòu),提示TLR4與動脈粥樣硬化形成與發(fā)展有關(guān)[4]。絕大多數(shù)TLR家族成員的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為MyD88依賴途徑,而 TLR4存在MyD88依賴途徑和MyD88非依賴途徑。MyD88依賴性途徑主要介導(dǎo) NF-κ B活化和細胞因子產(chǎn)生,而 MyD88的非依賴性途徑主要負責LPS誘導(dǎo)的干擾素、干擾素誘導(dǎo)蛋白-10、干擾素調(diào)節(jié)基因-1表達和DC成熟。MyD88依賴性途徑中參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的分子有 MyD88、IRAK、TRAF-6等,經(jīng)過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)最終激活NF-κ B[5];MyD88非依賴性途徑中參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的分子有TRAM及T RIF等。LPS是革蘭氏陰性菌外膜的主要成分,是最常見的病原相關(guān)分子模式。來自于大腸桿菌的LPS是TLR4的特異性激動劑,不激動其他TLRs[6]。因此本研究應(yīng)用純化的大腸桿菌LPS作為 TLR4激動劑,刺激人臍靜脈內(nèi)皮細胞,同時應(yīng)用益氣活血復(fù)方含藥血清進行干預(yù),研究益氣活血復(fù)方對T LR4及其下游MyD88依賴性通路及MyD88非依賴性通路的影響。

AS患者以氣虛血瘀證多見[7]。氣虛表現(xiàn)為倦怠乏力、少氣懶言、聲低息微等,瘀血證表現(xiàn)為刺痛、胸悶痛、唇甲青紫、口唇發(fā)紺、眩暈等。基本病機是各種原因?qū)е碌男年柟膭訜o力,心氣不能正常推動血液運行,而出現(xiàn)瘀血、痰濁、水飲、濕熱阻滯交互為患,病機的特點是本虛標實,即心陽鼓動無力,心氣不能正常推動血液運行為本,瘀血、痰濁、水飲等病理產(chǎn)物阻滯為病之標,在治療上一定要注意標本兼治?；钛鲭m然可以迅速起效于一時,但不可久服,當血瘀基本消退后,再繼續(xù)使用此法則會導(dǎo)致正氣進一步耗傷,即使血瘀為病情的主要矛盾,在應(yīng)用活血化瘀藥,癥狀緩解后也要迅速轉(zhuǎn)入對病本的治療。臨床上單純血瘀證并不多見,往往與痰濁-氣滯-氣虛等情況交互為患,而氣虛是AS發(fā)生、發(fā)展的根本病理基礎(chǔ)。氣虛則血行遲滯而成瘀血,水液不能布散則痰濁內(nèi)生,終至痰瘀互結(jié)脈道而致動脈硬化的發(fā)生。因此根據(jù)AS本虛標實的病理特點,以益氣活血中藥治療,氣血調(diào)和,癥狀自然改善。益氣活血復(fù)方具有補氣扶正、祛瘀除塞、流通氣血以達到振奮心陽、活血通絡(luò)等作用。從實驗結(jié)果分析,益氣活血復(fù)方各濃度組均能明顯下調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細胞T LR4的高表達,說明益氣活血復(fù)方對T LR4具有拮抗作用,同時益氣活血復(fù)方各濃度組均能明顯下調(diào)MyD88及T RAF-6的表達,而對TRAM和TRIF抑制作用不明顯,說明益氣活血復(fù)方通過阻斷TLR4胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的MyD88依賴性途徑,抑制下游NF-κ B以及各種相關(guān)基因表達,從而減少內(nèi)皮細胞的損傷以及各種炎癥反應(yīng)的發(fā)生,這可能是其抗動脈粥樣硬化的作用機制之一。此外,益氣活血復(fù)方各濃度組中高濃度組的效果最為明顯,說明益氣活血復(fù)方含藥血清對 TLR4、MyD88及TRAF-6高表達的抑制作用具有濃度依賴性。

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