大鼠腦挫傷后HIF-1α表達(dá)規(guī)律的實(shí)驗(yàn)性研究1)

陳國(guó)蕾,梁新華,焦 炎

低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要的缺氧感受因子,由α、β兩個(gè)亞基組成,其中α既是調(diào)節(jié)亞基,又是活性亞基。常氧條件下,哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心 肺、胎盤(pán)、骨骼肌和腎等組織內(nèi)均有HIF-1α的表達(dá),但含量很低,難以檢測(cè),但當(dāng)細(xì)胞缺血缺氧時(shí),HIF-1α表達(dá)就開(kāi)始增高,作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,其介導(dǎo)多種效應(yīng)基因的表達(dá),在缺血缺氧反應(yīng)過(guò)程發(fā)揮重要作用[1,2]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)對(duì)腦挫傷后不同時(shí)間段HIF-1α的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),建立HIF-1α的表達(dá)與腦挫傷經(jīng)過(guò)時(shí)間的關(guān)系,為法醫(yī)學(xué)腦挫傷經(jīng)過(guò)時(shí)間的推斷提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 健康成年SD大鼠64只(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),體重(250±10)g,雌雄不限,隨機(jī)分為8組,分別為對(duì)照組和挫傷后1 h組、4 h組、12 h組、48 h組、72 h組、7 d組、14 d組,每組 8只。

1.2 腦挫傷模型的建立及取材 參照Feeney法建立大鼠閉合性腦挫傷模型。大鼠稱重后,3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔麻醉,大鼠腦立體定位儀固定大鼠頭部,沿正中線切開(kāi)頭頂部皮膚,在人字縫前方3 mm、顱骨中線旁3 mm處,鉆直徑5 mm的圓形骨窗。保持硬腦膜完整,在硬腦膜上放置墊片,采用自由落體打擊裝置,以50 g重錘從20 cm高處垂直下落打擊一次,縫合皮膚,術(shù)后常規(guī)進(jìn)飲食。分別于傷后1 h、4 h、12 h、48 h、72 h、7 d、14 d頸椎脫臼處死動(dòng)物,開(kāi)顱,以腦挫傷灶為中心旁開(kāi)1 mm行大鼠腦冠狀切面取材,置于4%多聚甲醛PBS液中固定,對(duì)照組動(dòng)物直接處死,相同部位取材。

1.3 方法 甲醛中取出組織,常規(guī)酒精梯度脫水,石蠟包埋,切片(厚度4 μ m),石蠟切片脫蠟至水,常規(guī)行 HE染色,免疫組化SABC法操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,3%H2O2滅活內(nèi)源性酶,PBS沖洗;微波抗原修復(fù),PBS沖洗;5%小牛血清封閉,一抗稀釋度為 1∶100,4℃,過(guò)夜,PBS沖洗;二抗37℃,45 min;PBS沖洗;滴加SABC,0.5 h,PBS沖洗;DAB鏡下控制顯色,水洗,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,脫水,透明,封片。用PBS取代一抗作陰性對(duì)照,以細(xì)胞核或胞漿出現(xiàn)棕黃色產(chǎn)物為陽(yáng)性結(jié)果。兔HIF-1α IgG多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司,其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。運(yùn)用BI-2000圖像分析系統(tǒng),在腦挫傷區(qū)周圍隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×200),以損傷部位周圍出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性反應(yīng),進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間差異比較采用t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色結(jié)果 對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,核染色較淡、圓形,核仁清楚;損傷組可見(jiàn)腦實(shí)質(zhì)散在出血,蛛網(wǎng)膜下腔、側(cè)腦室出血。所選切面各部位均可見(jiàn)程度不一的神經(jīng)元細(xì)胞核深染、固縮,神經(jīng)元細(xì)胞水腫,周圍出現(xiàn)空隙,逐漸發(fā)展為胞核破碎溶解,神經(jīng)元壞死消失,周圍膠質(zhì)細(xì)胞增生。

2.2 HIF-1α免疫組織化學(xué)染色 傷后1 h即可觀察到陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞,呈散在少量分布,陽(yáng)性產(chǎn)物呈棕黃色,主要位于神經(jīng)細(xì)胞胞核及胞漿內(nèi)。對(duì)照組神經(jīng)細(xì)胞偶見(jiàn)HIF-1α表達(dá)。傷后12 h可見(jiàn)表達(dá)HIF-1α的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)增多,表達(dá)強(qiáng)度增強(qiáng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);48 h后達(dá)高峰,陽(yáng)性細(xì)胞聚集成簇,周圍可見(jiàn)大量棕黃色產(chǎn)物。隨后陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞逐漸減少,7 d后仍見(jiàn)少量表達(dá),14 d后基本恢復(fù)正常。詳見(jiàn)表1。組別 n 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

表1 腦挫傷后不同時(shí)間段HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s)個(gè)

表1 腦挫傷后不同時(shí)間段HIF-1α陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(±s)個(gè)

對(duì)照組 8 2.1±1.4 1 h組 8 12.7±2.11)4 h組 8 20.4±2.51)2)12 h組 8 48.8±3.91)2)48 h組 8 109.3±11.51)2)72 h組 8 77.5±4.71)2)7 d組 8 14.8±2.91)2)14 d組 8 3.4±1.42)與對(duì)照組比較,1)P＜0.05;與上一組比較,2)P＜0.05

3 討 論

腦組織細(xì)胞對(duì)缺血缺氧極為敏感,腦挫傷常會(huì)損傷血管神經(jīng),破壞腦血循環(huán)的調(diào)節(jié)功能,造成血流變慢,組織缺氧,細(xì)胞壞死,引發(fā)各種功能障礙。對(duì)腦挫傷的調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)多種酶、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞因子及相關(guān)蛋白在腦挫傷的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3-5]。HIF-1作為一種隨氧濃度變化而調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子,HIF-1α表達(dá)增加是缺血缺氧早期首發(fā)的分子水平的適應(yīng)性反應(yīng),它作為調(diào)節(jié)基因蛋白,可以促進(jìn)許多效應(yīng)基因的表達(dá),介導(dǎo)與缺氧有關(guān)的各種應(yīng)激反應(yīng)[6-8]。國(guó)內(nèi)外很多學(xué)者對(duì)HIF-1α在腦挫傷的表達(dá)機(jī)制及調(diào)節(jié)機(jī)制做了深入研究,發(fā)現(xiàn)HIF-1α可以誘導(dǎo)其靶基因如促紅細(xì)胞生成素、糖酵解酶、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子等激活,從而參與氧氣運(yùn)輸、能量代謝、血管構(gòu)建和細(xì)胞分化等機(jī)體的自我保護(hù)反應(yīng)[9-11]。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)模擬人的閉合性腦挫傷模型,采用免疫組化的方法對(duì)HIF-1α蛋白表達(dá)進(jìn)行觀測(cè),結(jié)果顯示HIF-1α表達(dá)主要分布于皮層、海馬和腦干,可能與這些部位對(duì)缺氧更為敏感有關(guān),在腦挫傷后1 h即可檢測(cè)到少量 HIF-1α蛋白表達(dá),到 4 h時(shí),HIF-1α蛋白表達(dá)開(kāi)始增強(qiáng),至48 h達(dá)高峰,7 d后仍有少量表達(dá),14 d后恢復(fù)正常。蘇莉等[12]通過(guò)制作彌漫性腦損傷模型對(duì)HIF-1α的變化規(guī)律進(jìn)行研究,免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)彌漫性腦損傷后1 h～2 h可在皮質(zhì)、丘腦和腦干等部位觀察到HIF-1α增多,12h達(dá)高峰,24h減弱。這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果有一定差異,可能是由于實(shí)驗(yàn)方法的不同,形成的損傷程度不同造成的。但兩者都表現(xiàn)出先逐漸升高,達(dá)到峰值后又逐漸下降的趨勢(shì)。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析原因可能為:腦挫傷早期,腦組織缺血缺氧所致的氧化應(yīng)激可以誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)升高,但是由于基因的表達(dá)需要經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程,所以早期HIF-1α的表達(dá)不明顯,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),HIF-1α的降解途徑阻斷以及基因表達(dá)持續(xù)增加,所以在48 h時(shí)達(dá)到一個(gè)高峰,隨后由于組織細(xì)胞自我修復(fù)以及對(duì)缺血缺氧的耐受,HIF-1α的表達(dá)逐漸下降直至恢復(fù)正常。綜上所述,HIF-1α的表達(dá)有一定的時(shí)間規(guī)律性,但是由于損傷程度的差異,單純通過(guò)對(duì)其表達(dá)量的檢測(cè)來(lái)推斷損傷時(shí)間是不可靠的,應(yīng)結(jié)合其他的形態(tài)學(xué)改變,以期得到更為可信的結(jié)果。

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