2，3-丁二醇發(fā)酵過程的菌體生物質回收利用初步研究

目前，國內(nèi)外生物行業(yè)發(fā)展迅速。在微生物發(fā)酵過程中，發(fā)酵末期的菌體往往不是目的產(chǎn)物，因此會產(chǎn)生大量的廢菌體。一般的處理方法是將廢菌體在污水處理廠中分解，或是燃燒處理，這不僅污染環(huán)境、破壞生態(tài),也造成了嚴重的資源和能源浪費[1～5]。若能循環(huán)利用廢菌體，不僅可以節(jié)能減排，還可節(jié)約資源，對于建設科技含量高、資源消耗少、環(huán)境污染小的新型產(chǎn)業(yè)具有重大而深遠的意義。

2，3-丁二醇(BD)是一種很有潛力的替代能源，燃燒值為27 200 kJ·kg-1，可進一步制得多種用途廣泛的衍生物，如甲乙酮、1，3-丁二烯[6]、辛烷[7]等。在脫氫酶的作用下，2，3-丁二醇可以氧化生成3-羥基-2-丁酮(乙偶姻，AC)，AC是一種應用廣泛、令人喜愛的食用香料[8,9]。國內(nèi)市場近幾年對2，3-丁二醇的需求逐年上升。

作者嘗試將粘質沙雷氏菌利用蔗糖生產(chǎn)2，3-丁二醇發(fā)酵過程中的廢菌體回收處理，研究并優(yōu)化回收廢菌體作為發(fā)酵培養(yǎng)基成分的方法。將廢菌體進行離心、懸浮、高壓均質、再離心等處理后，制備成溶菌液，作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源。對酵母粉和溶菌液分別作為氮源的發(fā)酵效果進行了比較，對多次回收廢菌體制備的溶菌液作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源進行了研究，并將溶菌液作為氮源的發(fā)酵條件在3.7 L發(fā)酵罐上進行放大驗證實驗。

1 實驗

1.1 溶菌液的制備

發(fā)酵末期的發(fā)酵液，用冷凍離心機于7000 r· min-1離心60 min，得到菌體沉淀，-20℃下冷凍保藏待用[10]。

融化冷凍的菌體，按菌體沉淀與去離子水質量比約為1∶4的比例，將菌體沉淀懸浮于去離子水中，得到懸浮菌液。在冷凍-融化的過程中，部分菌體發(fā)生了破碎。懸浮菌液在高壓均質機的作用下進行細胞破碎，壓力為80 MPa，循環(huán)破碎3次，溫度保持在30℃以下。均質后的液體，先用冷凍離心機于7000 r· min-1離心60 min，將較大顆粒沉淀去除，再用冷凍離心機于10 000 r· min-1離心30 min，去除沉淀，得到的上清液即為溶菌液。溶菌液在-20℃下冷凍保藏待用。

以酵母粉為氮源進行發(fā)酵，所得廢菌體制備成的溶菌液為Lysate 1；以Lysate 1為氮源進行發(fā)酵，所得廢菌體制備成的溶菌液為Lysate 2。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)，自行保藏，保存于斜面培養(yǎng)基中。

斜面培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖 20，酵母粉 10，蛋白胨 10，瓊脂粉 20，以NaOH調(diào)pH值7.0～7.2，115℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：葡萄糖10，酵母粉1，蛋白胨2，(NH4)2SO46，K2HPO410，NaCl 0.5，MgSO40.5，接種前以NaOH調(diào)pH值7.0～7.2，115℃滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1) ：蔗糖90，酵母粉25，檸檬酸三鈉14，MnSO40.05，NH4H2PO43，F(xiàn)eSO40.02，MgSO40.5，以NaOH調(diào)pH值7.0～7.2，115℃滅菌20 min。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ:以含氮量相當于25 g·L-1酵母粉的Lysate 1代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉作為氮源。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ:以含氮量相當于25 g·L-1酵母粉的Lysate 2代替基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母粉作為氮源。

1.3 儀器

KLF2000型3.7 L比歐發(fā)酵罐；Beckman J-26XP型離心機、J2-HS型離心機；AH110B型高壓均質機；UV-2008H型分光光度計；Aglient GC 9860型氣相色譜議；Vario EL Ⅲ型元素分析儀。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 菌種活化

取保藏菌種，劃線接種于斜面培養(yǎng)基中，30℃ 恒溫培養(yǎng)約24 h。

1.4.2 種子培養(yǎng)

在250 mL搖瓶中裝入30 mL種子培養(yǎng)基，接兩環(huán)保存在斜面培養(yǎng)基上的種子至種子培養(yǎng)基中，于30℃、200 r· min-1下?lián)u床培養(yǎng)11～12 h。

1.4.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

Yeast extract組和Lysate組分別利用基礎發(fā)酵培養(yǎng)基和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ。按5%(體積分數(shù))的接種量轉接種子液至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于30℃、200 r· min-1下?lián)u床培養(yǎng)，蔗糖消耗完，發(fā)酵結束。

1.4.4 以多次回收廢菌體制備的溶菌液作為氮源的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

Yeast extract組、Lysate 1組和Lysate 2組分別利用基礎發(fā)酵培養(yǎng)基、優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ和優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅱ。按5%(體積分數(shù))的接種量轉接種子液至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于30℃、200 r· min-1下?lián)u床培養(yǎng)，蔗糖消耗完，發(fā)酵結束。

1.4.5 連續(xù)補料發(fā)酵培養(yǎng)

利用優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基Ⅰ。取100 mL種子液接種于3.7 L比歐發(fā)酵罐，起始裝液量為1.8 L，起始攪拌轉速為300 r· min-1，通氣量為1 vvm，發(fā)酵溫度為30℃。初始蔗糖濃度為90 g·L-1，當殘留蔗糖(Residual sucrose)濃度小于10 g·L-1時，采用流加式連續(xù)補料，補入濃度為80%的蔗糖水溶液，使發(fā)酵罐中殘留蔗糖濃度保持在10～30 g·L-1。培養(yǎng)41～45 h，發(fā)酵結束。根據(jù)實驗要求，通過調(diào)節(jié)攪拌轉速來實現(xiàn)發(fā)酵液中的不同溶氧水平。

1.5 測定方法

1.5.1 菌體濃度測定

采用分光光度計在波長600 nm下測定吸光度(OD)，細胞干重(DCW，g·L-1)由標準曲線(DCW=0.422×OD-0.0363)換算獲得。

1.5.2 發(fā)酵液中殘留蔗糖濃度的測定

樣品經(jīng)離心，取上清液用2 mol·L-1H2SO4水解，再用4 mol·L-1NaOH中和，用葡萄糖液體試劑盒(上海捷門生物技術公司)測出葡萄糖濃度，再換算成殘留蔗糖濃度。

1.5.3 產(chǎn)物測定

發(fā)酵液離心后用乙酸乙酯萃取，通過氣相色譜儀來測定AC和BD的濃度。

色譜柱采用毛細管柱DB-5，并采用FID氫火焰檢測器，氮氣作為載氣，流速為1 mL· min-1，柱溫為50℃，保留1.5 min，25℃· min-1升溫到180℃，保留10 min，進樣口溫度為215℃，檢測器溫度為245℃。

1.5.4 酵母粉和溶菌液中含氮量和含碳量的測定

用真空冷凍干燥機將溶菌液冷凍干燥制成粉末；用元素分析儀測定酵母粉和溶菌液粉末中碳、氮、氫元素的含量[11]。根據(jù)酵母粉和溶菌液的含氮量，確定發(fā)酵培養(yǎng)基中添加溶菌液的量。

2 結果與討論

2.1 酵母粉和溶菌液的含氮量

酵母粉和溶菌液粉末中碳、氮、氫元素的含量如表1所示。

表1 酵母粉和溶菌液中N、C、H元素的含量

由表1可知，Lysate 1比安琪酵母粉的含氮量低，Lysate 2比Lysate 1的含氮量低。這可能是因為，利用溶菌液作為氮源進行發(fā)酵，由于缺少某些金屬離子，菌體衰亡比較快，菌體碎片和靈菌紅素等物質較多，因此，經(jīng)高壓均質等工藝制備成的溶菌液含氮量較低。

2.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

圖1 酵母粉和溶菌液作為氮源的比較

由圖1可知，從菌體生長情況看，溶菌液作為氮源比酵母粉作為氮源的最大細胞干重要大，達7.5 g·L-1，說明利用溶菌液作為氮源對于菌體生長沒有不利的影響；18 h發(fā)酵結束時，酵母粉作為氮源的殘留蔗糖濃度為0.5 g·L-1，而溶菌液作為氮源的殘留蔗糖濃度為9.04 g·L-1，此時，兩者的BD濃度分別為41.6 g·L-1和39.3 g·L-1，產(chǎn)物濃度相當。由此可知，用溶菌液代替酵母粉作為氮源進行發(fā)酵具有可行性。

2.3 多次回收溶菌液作為氮源實驗(圖2)

圖2 多次回收廢菌體制成溶菌液的分批實驗

由圖2可知，與利用酵母粉和Lysate 1相比，利用Lysate 2的菌體生長情況相差不大，最大細胞干重為7.65～7.83 g·L-1；但是利用Lysate 2的BD濃度略低于利用酵母粉和Lysate 1，酵母粉和Lysate 1作為氮源發(fā)酵末期的BD濃度分別為41.6 g·L-1和43.7 g·L-1，而Lysate 2作為氮源發(fā)酵末期的BD濃度為38.2 g·L-1。雖然利用Lysate 2作為氮源發(fā)酵末期的BD濃度偏低，但是AC和BD的總濃度與利用酵母粉的相當，分別為45.28 g·L-1和45.08 g·L-1。利用Lysate 2部分取代氮源對于節(jié)能減排具有積極的意義，可以通過優(yōu)化，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一些元素，彌補Lysate 2中不足的成分，提高合成BD的濃度。

2.4 連續(xù)補料發(fā)酵培養(yǎng)(圖3)

圖3 溶菌液作為氮源的3.7 L發(fā)酵罐實驗

連續(xù)補料發(fā)酵培養(yǎng)，42 h 結束時，BD濃度為109.2 g·L-1，殘留蔗糖濃度為5.2 g·L-1，共有221.95 g·L-1蔗糖被消耗，2，3-丁二醇轉化率達到0.492 g·g-1，產(chǎn)率達到2.6 g·L-1·h-1。2，3-丁二醇發(fā)酵屬于微耗氧發(fā)酵，對氧的要求非常嚴格，其途徑是一種混合酸途徑，形成的有機酸包括乙酸、乳酸和丁二酸等[12]。由圖3可以看出，發(fā)酵后期，菌體濃度下降趨勢較快，這可能是發(fā)酵后期有機酸等副產(chǎn)物積累過多所致。

2.5 討論

本研究中，溶菌液是回收發(fā)酵末期粘質沙雷氏菌廢菌體制備而成，溶菌液含有可供菌體生長和產(chǎn)物合成的某些營養(yǎng)物質，特別是各種氨基酸類物質[13]，可替代酵母粉，作為發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源。另外，溶菌液具有制備工藝簡單的特點。因此，不但可以一定程度上減少發(fā)酵過程中廢菌體的排放，還可以減少對部分原料的需求。

3 結論

將粘質沙雷氏菌利用蔗糖生產(chǎn)2，3-丁二醇發(fā)酵末期的廢菌體回收利用，制備成溶菌液，替代發(fā)酵過程中的氮源。搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中，2，3-丁二醇濃度為 39.3 g·L-1，與酵母粉作為氮源相比，產(chǎn)物濃度相當。多次回收廢菌體制成溶菌液替代酵母粉作為氮源，2，3-丁二醇濃度略低。連續(xù)補料發(fā)酵培養(yǎng)中，共有221.95 g·L-1蔗糖被利用，2，3-丁二醇最高濃度為109.2 g·L-1，2，3-丁二醇轉化率達到0.492 g·g-1、產(chǎn)率達到2.6 g·L-1·h-1。由此表明，回收廢菌體基本具有節(jié)能減排的可行性。

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