新月彎孢霉KA-91轉(zhuǎn)化異羥基洋地黃毒苷元的研究

強(qiáng)心苷是一類對心臟具有顯著生物活性的甾體皂苷類化合物，具有增強(qiáng)心肌收縮力等作用，是臨床上用于治療心力衰竭等疾病的一線輔助藥物[1]。但由于其排泄緩慢、容易在體內(nèi)蓄積、治療劑量與中毒劑量非常接近等缺點，限制了其應(yīng)用[2]。地高辛是一種臨床常用的強(qiáng)心苷類藥物，由異羥基洋地黃毒苷元在C3位連接三個洋地黃毒糖構(gòu)成。

采用微生物轉(zhuǎn)化法對強(qiáng)心苷類藥物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾已成為強(qiáng)心苷類藥物研究的熱點領(lǐng)域之一[3～6]。有文獻(xiàn)報道藍(lán)色犁頭霉(Absidiacoerulea)、雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)ATCC 6476、米曲霉(Aspergilliusoryzae)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)ATCC 6227在洋地黃毒苷元的1β、5β、7β位點上具有羥基化能力。球毛殼霉菌(Chaetomiumglobosum)MN-211轉(zhuǎn)化洋地黃毒苷得到7β-羥基化產(chǎn)物；蠅卷霉(Circinellamuscae)MN-120轉(zhuǎn)化洋地黃毒苷得到12β-羥基化產(chǎn)物[6]。

新月彎孢霉(Curvularialunata)細(xì)胞內(nèi)含有P450酶系，被廣泛用于甾體化合物的羥基化過程[7，8]。異羥基洋地黃毒苷元在分子結(jié)構(gòu)上與洋地黃毒苷元的結(jié)構(gòu)相似。作者在此以地高辛和異羥基洋地黃毒苷元為底物，利用新月彎孢霉KA-91對其進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并對轉(zhuǎn)化工藝進(jìn)行了初步優(yōu)化研究。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 菌種

新月彎孢霉KA-91 ，天津科技大學(xué)微生物制藥研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g·L-1)： 葡萄糖22，酵母膏4，牛肉膏5，pH值6.5。

1.1.3 藥品、試劑和儀器

地高辛(純度98%)，西安山川生物技術(shù)有限公司；異羥基洋地黃毒苷元(純度98%)，自制；氯仿、乙酸乙酯、無水乙醇等均為市售分析純；甲醇為色譜純；薄層硅膠板GF254,德國默克公司。

HYG-Ⅱ型回旋式恒溫調(diào)速搖瓶柜；YJ-875S型醫(yī)用凈化臺；WS2-134-75型電熱恒溫培養(yǎng)箱；GB204型電子分析天平；Gilson型微量取樣器；三用紫外分析儀；Agilent1100型高效液相色譜分析儀；Bruker AV-600型核磁共振儀；傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜FT-ICR-MS。

1.2 方法

1.2.1 異羥基洋地黃毒苷元的制備

采用稀鹽酸水解地高辛制備異羥基洋地黃毒苷元。用含0.02 mol·L-1HCl的80%乙醇溶液水解20 mg·mL-1地高辛,水浴80℃回流酸解2～3 h[9]，用氯仿萃取，硅膠柱分離純化，得白色粉末,經(jīng)1HNMR、13CNMR和高分辨質(zhì)譜檢測，鑒定其為異羥基洋地黃毒苷元。

1.2.2 菌體的培養(yǎng)

新月彎孢霉KA-91接種于斜面培養(yǎng)基，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。用無菌水洗下保藏斜面霉菌的孢子，制備濃度為3.0×106個·mL-1的孢子懸液。取1 mL孢子懸液接種到含有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中， 于28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h。

1.2.3 異羥基洋地黃毒苷元的生物轉(zhuǎn)化

菌體培養(yǎng)24 h后，分別加入用無水乙醇溶解配制的135 mmol·L-1地高辛溶液和135 mmol·L-1異羥基洋地黃毒苷元溶液，于28℃、180 r·min-1繼續(xù)培養(yǎng)48 h，終止發(fā)酵。

1.2.4 產(chǎn)物的分離提取與純化

轉(zhuǎn)化結(jié)束后，抽濾，分離菌絲體和發(fā)酵液，分別用50 mL乙酸乙酯萃取菌絲體和發(fā)酵液3次，合并萃取液，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮。采用硅膠色譜柱分離產(chǎn)物，洗脫劑為氯仿-甲醇(25∶1)。

1.3 分析與檢測

采用TLC薄層色譜法分析。展開劑為氯仿-甲醇-苯(10∶2∶5)，10%硫酸乙醇溶液噴霧顯色，其中異羥基洋地黃毒苷元的Rf值為0.325，產(chǎn)物的Rf值為0.388。

HPLC法檢測轉(zhuǎn)化率。在室溫下，流動相為甲醇-水( 55∶45)，流量為0.7 mL·min-1，檢測波長為220 nm。

產(chǎn)物純品的1HNMR和13CNMR采用Brucker AV-600 型核磁共振儀測定，以TMS為內(nèi)標(biāo)，樣品溶解在C5D5N中。產(chǎn)物純品溶于甲醇中，用于FT-ICR-MS檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

新月彎孢霉KA-91對地高辛和異羥基洋地黃毒苷元的轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，新月彎孢霉KA-91對地高辛不具有轉(zhuǎn)化能力，對異羥基洋地黃毒苷元具有轉(zhuǎn)化能力，經(jīng)結(jié)構(gòu)鑒定轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為3-羰基-異羥基洋地黃毒苷元。

異羥基洋地黃毒苷元:白色粉末，不溶于氯仿，易溶于吡啶，分子式C23H34O5。FT-ICR-MS，m/z：413.2298 [M+ Na]+1。1HNMR(C5D5N)，δ：0.98(3H，S，Me-18)，1.23(3H，S，Me-19)，3.73( 1H，m，H-17)，4.3(1H，S，H-3)，5.25(1H， d，H-21a，J=18)，5.10(1H，d ，H-21b，J=18)，6.22(1H，S，H-22)。13CNMR(C5D5N)，δ：30.06(C-1)，28.20 (C-2)， 65.60 (C-3)，33.87 (C-4)，36.33 (C-5)，26.88 (C-6)，21.96 (C-7)，41.35 (C-8)，32.45 (C-9)，35.31 (C-10)，30.45 (C-11)，74.28 (C-12)，56.37 (C-13)，85.04 (C-14)，33.13 (C-15)，27.46 (C-16)，46.22 (C-17)，9.68 (C-18)，23.64 (C-19)，174.18 (C-20)，73.55 (C-21)，116.98 (C-22)，176.02 (C-23)。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]一致。

3-羰基-異羥基洋地黃毒苷元:白色粉末，不溶于氯仿，易溶于吡啶，分子式C23H32O5，F(xiàn)T-ICR-MS，m/z：411.2142 [M+ Na]+1。1HNMR(C5D5N),δ:0.88(3H，S，Me-18)，1.24(3H，S，Me-19)，3.74( 1H，m，H-17)，5.25(1H， d，H-21a，J=18)，5.11(1H，d ，H-21b，J=18)，6.23(1H，S，H-22)。13CNMR(C5D5N)，δ：36.97 (C-1)，37.27 (C-2)，211.19 (C-3)，42.41 (C-4)，43.97 (C-5)，27.06 (C-6)，21.91 (C-7)，41.58 (C-8)，33.57 (C-9)，35.37 (C-10)，30.80(C-11)，74.43 (C-12)，56.85 (C-13)，85.29 (C-14)，30.87 (C-15)，27.91 (C-16)，46.66(C-17)，10.15(C-18)，22.57(C-19)，174.63 (C-20)，74.02 (C-21)，117.58 (C-22)，176.32 (C-23)。波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]一致。

2.2 新月彎孢霉KA-91轉(zhuǎn)化異羥基洋地黃毒苷元反應(yīng)

新月彎孢霉KA-91對異羥基洋地黃毒苷元的轉(zhuǎn)化反應(yīng)如圖1所示。

圖1 新月彎孢霉KA-91對異羥基洋地黃毒苷元的轉(zhuǎn)化

由圖1可知，新月彎孢霉KA-91可以特定位點地氧化異羥基洋地黃毒苷元C3-OH轉(zhuǎn)為羰基，但不氧化C12-OH。

2.3 轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化

2.3.1 底物濃度對轉(zhuǎn)化的影響

新月彎孢霉KA-91轉(zhuǎn)化異羥基洋地黃毒苷元時，底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響見圖2。

圖2 底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

由圖2可知，底物濃度在0.15～0.90 mmol·L-1范圍內(nèi)，隨著其濃度的增加，轉(zhuǎn)化率先上升再下降；在底物濃度為0.60 mmol·L-1時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值27.3%。因此，選擇新月彎孢霉KA-91轉(zhuǎn)化異羥基洋地黃毒苷元的最適底物濃度為0.60 mmol·L-1。

2.3.2 培養(yǎng)基初始pH值對轉(zhuǎn)化的影響(圖3)

圖3 培養(yǎng)基初始pH值對轉(zhuǎn)化率的影響

由圖3可知，培養(yǎng)基初始pH值在5.0～8.0之間時，轉(zhuǎn)化率先上升再下降；在培養(yǎng)基的初始pH值為6.0時，轉(zhuǎn)化率達(dá)到最大值38%。因此，選擇新月彎孢霉KA-91轉(zhuǎn)化異羥基洋地黃毒苷元的最適pH值為6.0。

2.3.3 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化的影響(圖4)

由圖4可知，轉(zhuǎn)化溫度在28℃時轉(zhuǎn)化率最高。這是因為新月彎孢霉KA-91的適宜生長溫度為26～30℃，在28℃時酶的表達(dá)量最大，轉(zhuǎn)化率最高；溫度超過28℃后雖然生物量有所增加但酶的表達(dá)量反而下降。因此，選擇新月彎孢霉KA-91轉(zhuǎn)化異羥基洋地黃毒苷元的最適轉(zhuǎn)化溫度為28℃。

圖4 轉(zhuǎn)化溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

2.3.4 轉(zhuǎn)化過程曲線

新月彎孢霉在培養(yǎng)24 h后進(jìn)入對數(shù)生長期[7]，此時，加入底物，考察新月彎孢霉KA-91對異羥基洋地黃毒苷元的轉(zhuǎn)化過程，結(jié)果見圖5。

圖5 新月彎孢霉KA-91轉(zhuǎn)化生成3-羰基-異羥基洋地黃毒苷元的過程曲線

由圖5可知，在轉(zhuǎn)化24～54 h過程中，隨著轉(zhuǎn)化時間的延長，轉(zhuǎn)化率相應(yīng)上升；當(dāng)轉(zhuǎn)化54 h時，轉(zhuǎn)化率最高達(dá)到40%；隨著轉(zhuǎn)化時間的繼續(xù)延長，菌體衰老，轉(zhuǎn)化率不再上升。因此，選擇新月彎孢霉KA-91對異羥基洋地黃毒苷元的最適轉(zhuǎn)化時間為54 h。

3 結(jié)論

(1)新月彎孢霉KA-91對地高辛沒有轉(zhuǎn)化能力，對異羥基洋地黃毒苷元具有轉(zhuǎn)化能力，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物通過1HNMR、13CNMR和傅立葉變換高分辨質(zhì)譜分析，確定其為3-羰基-異羥基洋地黃毒苷元。

(2)確定新月彎孢霉KA-91轉(zhuǎn)化異羥基洋地黃毒苷元的最優(yōu)工藝為：新月彎孢霉KA-91在28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基初始pH值為6.0，裝液量為50 mL·(250 mL)-1,加入底物的無水乙醇溶液(135 mmol·L-1)，使轉(zhuǎn)化液中異羥基洋地黃毒苷元初始濃度達(dá)到0.60 mmol·L-1，轉(zhuǎn)化54 h。此時，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到40%。

參考文獻(xiàn)：

[1] 宋曉凱.天然藥物化學(xué)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2004：206-207.

[2] 尤中良.家庭慎用強(qiáng)心藥[J].醫(yī)藥與保健，2004，(9)：56-57.

[3] D?ller P C, Alfermann A W, Reinhard E. Biotransformation of cardenolides by cell suspension cultures ofDigitalislanataandThevetianeriifolia[J].Planta Med,1977,31(1):1-6.

[4] Alfermann A W, Schuller I， Reinhard E.Biotransformation of ca-rdiac glycosides by immobilized cells ofDigitalislanata[J].Planta Med,1980,40(2):218-223.

[5] Kreis W, Reinhard E.12β-Hydroxylation of digitoxin by suspension-culturedDigitalislanatacells: Production of digoxin in 20-litre and 300-litre air-lift bioreactors[J].J Biotechnol,1992,26(2-6):257-273.

[6] Pádua Rodrigo M, Oliveira Alaíde B, Souza Filho José D, et al. Biotransformation of digitoxigenin byFusariumciliatum[J]. J Braz Chem Soc, 2005,16(3B):614-619.

[7] 王敏,郭亞文,盧文玉,等.氫化可的松高轉(zhuǎn)化菌株的選育及其發(fā)酵條件[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報,2004,10(5):663-666.

[8] 馮冰,馬百平,康利平,等.新月彎孢霉對重樓皂苷的生物轉(zhuǎn)化[J].中草藥,2005,36(7):978-983.

[9] 姚新生．天然藥物化學(xué)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：321-327.