酶法制備大豆多肽的研究

呂育新

（哈高科大豆食品有限責(zé)任公司，哈爾濱150086）

大豆蛋白與乳、肉和雞蛋等動(dòng)物蛋白相比具有較高的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，但由于大豆蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量較大，分子高度壓縮、折疊，從而使其消化率和生物效價(jià)遠(yuǎn)不及動(dòng)物蛋白。

蛋白質(zhì)的酶解是改善蛋白質(zhì)特性的一種很好的方式，大豆蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶水解后生成大豆多肽和大豆寡肽，更易被人體消化吸收；另外，大豆肽還具有多種生理功能和較高的營養(yǎng)價(jià)值。因此，大豆蛋白水解物通過選擇不同種類的蛋白酶、控制水解度的大小，可以得到具有不同生理活性的肽，這一領(lǐng)域是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)［1-3］。本實(shí)驗(yàn)確定了Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白的最佳條件，提出了采用Alcalase酶和Flavourzyme酶雙酶法分步酶解工藝來生產(chǎn)低苦味大豆多肽的方法，并得到了分子量不同的多肽產(chǎn)物。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大豆蛋白（哈高科大豆食品有限責(zé)任公司）、Alcalase酶（丹麥 NovoNordisk公司提供）、Flavourzyme酶（丹麥NovoNordisk公司提供）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分析方法 Alcalase蛋白酶的酶活力測(cè)定方法：參照QB/T1803-1993蛋白酶活力的測(cè)定方法；

Flavourzyme風(fēng)味酶活力測(cè)定方法：參照QB/T1803-1993蛋白酶活力的測(cè)定方法；

DH值(水解度)測(cè)定方法：采用pH-stat法，計(jì)算公式為：

式中：B為消耗堿量；

N為NaOH摩爾濃度；

α為大豆蛋白氨基的平均解離度0.44；

h為每克蛋白質(zhì)底物具有的肽鍵毫摩爾數(shù)，對(duì)于大豆蛋白h=7175。

氨基酸態(tài)氮的測(cè)定方法：參照ZBX66014-87。

1.2.2 大豆蛋白預(yù)處理 大豆蛋白溶液在90℃溫度下加熱處理約10min，使大豆蛋白致密的立體結(jié)構(gòu)變得松散，有利于提高大豆蛋白的酶解速率。

1.2.3 大豆蛋白的酶解反應(yīng)操作 稱取大豆蛋白加入適量水配制成一定濃度的大豆蛋白溶液，經(jīng)恒溫水浴預(yù)處理后，調(diào)節(jié)溫度至反應(yīng)溫度，根據(jù)文獻(xiàn)［4，5］，調(diào)節(jié)pH值至該反應(yīng)的最適pH值8.0，加入一定量Alcalase堿性蛋白酶，在反應(yīng)溫度下進(jìn)行恒溫酶解，酶解過程中要不斷攪拌，同時(shí)滴加0.1mol/L的NaOH溶液以保持反應(yīng)體系pH值恒定，反應(yīng)偏差一般控制在±0.1。每隔15min記錄NaOH用量，并以水解度加以比較，待水解結(jié)束后在攪拌條件下迅速升溫至90℃滅酶，酶解液用于Flavourzyme風(fēng)味酶的酶解研究。

1.2.4 利用單因素試驗(yàn)確定水解條件

1.2.4.1 水解溫度的確定 在底物濃度為6%，酶與底物濃度比為2%不變的情況下，水解溫度分別為40℃，50℃，60℃，70℃，水解大豆蛋白 120min；以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定最佳的水解溫度。

1.2.4.2 底物濃度的確定 在上述最佳的水解溫度條件下，酶與底物濃度比為2%，底物濃度分別為4%，6%，8%的情況下水解大豆蛋白120min；以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定最佳的底物濃度。

1.2.4.3 酶與底物濃度比的確定 在上述最佳溫度和底物濃度的條件下，酶與底物濃度比分別為2%、4%、6%的情況下水解大豆蛋白120min；以水解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)確定最佳的酶與底物濃度比。

1.2.5 Flavourzyme風(fēng)味酶的酶解 當(dāng)大豆蛋白水解反應(yīng)后，得到淺棕色半透明液體。該溶液呈現(xiàn)出苦味。采用Flavourzyme酶繼續(xù)水解8h，可以有效的減少水解液的苦味，水解完成后冷卻用4000r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，取上清液于試管中，置冰箱中備用。

1.2.6 水解產(chǎn)物肽分子量的確定

1.2.6.1 測(cè)定條件 紫外檢測(cè)波長為280nm，洗脫液的pH值為4.0，用0.0175mol/L磷酸二氫鈉加入0.1mol/L HCl進(jìn)行調(diào)節(jié)，流速為0.4mL/min，加入樣量為0.6mL。

1.2.6.2 分析方法 取已經(jīng)預(yù)處理好的交聯(lián)葡萄糖凝膠（G25）裝柱，并用洗脫液處理2個(gè)柱體積后，然后加入樣品0.4mL，用記錄儀記錄其流出吸收情況，計(jì)算出相應(yīng)的流出體積。

分別取氧化型谷胱甘肽（Mw=612），維生素(B12=1355)，胰島素(Mw=5733）1mg，溶于 5mL 洗脫液中，按上述操作進(jìn)行分析，并確定各種物質(zhì)最大吸收峰時(shí)洗脫液的流出體積（mL）。

以氧化型谷胱甘肽（Mw=612），維生素(B12=1355)，胰島素(Mw=5733）為分子量參照物，以各種物質(zhì)分子量對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（lgM），最大吸收峰時(shí)洗脫液的流出體積（mL）為橫坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，稱取水解產(chǎn)物干品50mg，用蒸餾水定容到5mL，過葡聚糖凝膠(Sephadex G-25)柱，用記錄儀記錄其流出液吸收情況，計(jì)算出相應(yīng)的流出體積。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的分子量。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 Alcalase酶和Flavourzyme風(fēng)味酶的酶活

Alcalase酶的酶活：6.9×104U/g；Flavourzyme風(fēng)味酶的酶活：1.4×104U/g

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 溫度對(duì)水解度的影響 本試驗(yàn)在底物濃度為6%，酶與底物濃度比為2%不變的條件下，控制水解溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃，在pH值8.0±0.1條件下水解120min。

從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中可看出水解度與水解溫度呈正相關(guān)，在70℃時(shí)水解度達(dá)到最大。但由于在70℃時(shí)水解過快，pH下降也很快，很難使pH值維持在8.0±0.1，另外根據(jù)Alcalase堿性蛋白酶酶學(xué)特性，如果溫度繼續(xù)升高，高溫會(huì)使酶失活，導(dǎo)致蛋白酶水解能力下降，由此確定Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白的最適溫度為60℃。

2.2.2 底物濃度對(duì)水解度的影響 控制水解溫度為60℃，酶與底物濃度比2%不變，維持水解液的pH 8.0±0.1，采用的底物濃度分別為4%、6%、8%，水解大豆蛋白120min。以大豆蛋白的水解度為指標(biāo)，確定Alcalase堿性蛋白酶單酶水解大豆蛋白的最佳底物濃度。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在相同的水解時(shí)間條件下，底物濃度越低水解度越大。這是由于底物濃度過高，體系流動(dòng)性差，不利于酶與底物的接觸。因此，認(rèn)為底物濃度為4%時(shí)效果較好。

2.2.3 酶與底物濃度比對(duì)水解效果的影響 控制水解溫度60℃，大豆蛋白水解溶液pH 8.0±0.1，底物濃度4%，采用酶與底物比分別為2%、4%、6%的條件下進(jìn)行水解，水解120min。以大豆蛋白的水解度為指標(biāo)，確定最佳的酶與底物濃度比。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，雖然酶與底物比為6%時(shí)，蛋白質(zhì)的水解程度最大，但是6%的酶與底物比生產(chǎn)成本較高。當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，酶與底物比為2%和4%時(shí)的水解度僅比6%時(shí)小約5%。因此，從生產(chǎn)成本上考慮，選用酶與底物比為2%。

2.3 水解產(chǎn)物的分子量確定

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 各種標(biāo)準(zhǔn)樣品的分子量與最大洗脫體積見附表，并按最大洗脫體積對(duì)各物質(zhì)分子量的對(duì)數(shù)值（l gM）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1）。

附表 標(biāo)準(zhǔn)分子量的流出體積

圖1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.2 水解產(chǎn)物的分子量分析 取經(jīng)過Flavourzyme酶水解4h、8h的水解產(chǎn)物上清液各2mL，過葡聚糖凝膠（SephadexG-25）柱，用記錄儀記錄其流出液吸收情況，記錄最大洗脫體積出現(xiàn)時(shí)的時(shí)間，則最大洗脫體積可以通過洗脫流速與洗脫時(shí)間的乘積求得。

圖2 水解4h產(chǎn)物洗脫時(shí)間分布圖

圖3 水解8h產(chǎn)物洗脫時(shí)間分布圖

分析條件為：檢測(cè)波長280nm，洗脫液：pH=4.0的磷酸緩沖液，流速：0.4mL/min，溫度：室溫，加樣量：5mL。

兩組溶液分別得到的最大洗脫時(shí)間如圖2、圖3所示，并由上述標(biāo)準(zhǔn)曲線求得所得肽的分子量，比較Flavourzyme酶水解時(shí)間對(duì)產(chǎn)物分子量的影響。

由圖2和圖3可知，隨著水解時(shí)間的延長，水解程度的加深，肽平均分子量逐漸降低，說明水解度增大后，大肽分子數(shù)量減少，使肽平均分子量降低。當(dāng)水解4h時(shí)，得到三種肽的出峰時(shí)間，分別約為120、150和 160min，肽分子量分別約為 471、2858、2425；當(dāng)水解8h后，所得多肽的最大出峰時(shí)間約為149min，肽分子量約為2865，其余小肽出峰不明顯，說明隨著水解時(shí)間的延長，水解產(chǎn)物分子量變小，水解得更徹底，這時(shí)候大豆多肽多以寡肽形式存在，易于被人體消化吸收。

3 小結(jié)

（1）Alcalase蛋白酶水解大豆蛋白的較佳條件為：Alcalase堿性蛋白酶水解大豆蛋白的最適溫度為60℃；底物濃度為4%；酶與底物比為2%。

（2）向上述水解反應(yīng)后的水解液中加入560U/g的Flavourzyme酶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著水解時(shí)間的延長水解液中氨基酸態(tài)氮含量增加，根據(jù)感觀評(píng)定，水解液苦味變淡。

（3）通過對(duì)水解產(chǎn)物的分子量分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：隨著水解時(shí)間的延長，水解產(chǎn)物分子量變小，水解得更徹底，這時(shí)候大豆多肽多以寡肽形式存在。

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