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    野生大豆與栽培大豆的同工酶分析*

    2010-06-04 05:12:14韓琳娜周鳳琴
    大豆科技 2010年1期
    關(guān)鍵詞:野生大豆同工酶親緣

    韓琳娜,周鳳琴

    (山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,濟(jì)南250355)

    大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)是我國(guó)主要的油料作物之一,已有五千年栽培歷史,通常被認(rèn)為是由野生大豆(Glycine soja Sieb.et Zucc.)馴化而來(lái)[1]。野生大豆具有耐鹽堿、抗寒、抗病等許多優(yōu)良性狀[2,3],是重要的野生資源植物,蘊(yùn)藏著豐富的遺傳多樣性。野生大豆在黃河三角洲有大面積分布,墾利縣大汶流最多,常形成單一的野生大豆群落[4]。近年來(lái),對(duì)野生大豆和栽培大豆的比較研究多見(jiàn)于有效成分比較[5]、種子貯藏蛋白研究[6]、生化及分子生物學(xué)分析[7、8]、抗逆性研究[9、10],而黃河三角洲野生大豆與栽培大豆同工酶的比較分析尚未見(jiàn)報(bào)道。

    同工酶是基因表達(dá)的產(chǎn)物,特異的基因表達(dá)產(chǎn)生特異的同工酶酶譜。目前同工酶已被廣泛的應(yīng)用于植物系統(tǒng)演化研究、種質(zhì)資源的鑒定及親緣關(guān)系的研究等方面,都取得了良好的效果[11]。本實(shí)驗(yàn)利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)分析東營(yíng)市河口區(qū)的野生大豆和山東4個(gè)栽培大豆的過(guò)氧化物酶和酯酶同工酶酶譜特征,從而有助于進(jìn)一步了解野生大豆與栽培大豆之間的親緣關(guān)系及進(jìn)化,為野生大豆資源的開(kāi)發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    野生大豆采自黃河三角洲東營(yíng)市河口區(qū)濱海濕地,栽培大豆魯豆1、魯豆10、河豆12和中黃20均購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院。上述材料的種子播種于藥用植物園。所有材料經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)周鳳琴教授鑒定。

    1.2 方法

    1.2.1 樣品處理 種子萌發(fā)后,同一時(shí)間取其新鮮幼嫩葉片0.5g,加1mL提樣緩沖液和少量石英砂,在冰浴中研成勻漿,以2mL提取液分幾次洗入離心管,然后在4℃以8000r/min離心10min,取上清液,加入等量40%蔗糖溶液,搖勻,置于-20℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.2 電泳 采用雙面垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳,2種同工酶分離膠濃度均為7.5%,濃縮膠濃度均為3%。點(diǎn)樣30uL,0.1%溴酚藍(lán)作為前沿指示劑,pH 8.3Tris-甘氨酸緩沖液作為電極緩沖液。于4℃冰箱中220V電壓條件下電泳,待指示劑距玻璃板末端1.0cm處停止電泳。

    1.2.3 染色 POD同工酶采用醋酸聯(lián)苯胺法(4mL聯(lián)苯胺貯液+18mL H2O+2滴 H2O2)染色,常溫下染色5min左右,水沖洗后照相。EST同工酶采用醋酸奈酯-堅(jiān)牢藍(lán)RR鹽法(α-醋酸奈酯25mg,β-醋酸奈酯25mg,堅(jiān)牢藍(lán)RR 50mg+少許丙酮+75mL pH 6.5的磷酸緩沖液)染色,常溫下染色25min左右,水沖洗后照相。

    1.2.4 數(shù)據(jù)分析 依據(jù)電泳照片,記錄數(shù)據(jù),求出相對(duì)遷移率和相似系數(shù)。酶帶的相對(duì)遷移率(Rf)=酶帶的遷移距離/溴酚藍(lán)的遷移距離;同工酶酶譜間相似系數(shù)c=2w/(a+b),其中c為酶譜間相似系數(shù),w為A和B兩個(gè)分類(lèi)群相同的酶帶數(shù),a為分類(lèi)群A在酶譜中的酶帶數(shù),b為分類(lèi)群B在酶譜中的酶帶數(shù)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 POD同工酶

    野生大豆與栽培大豆的過(guò)氧化物酶同工酶譜見(jiàn)圖1。

    從圖1可知,野生大豆與栽培大豆的過(guò)氧化物同工酶譜型存在差異。栽培大豆共有9條酶帶,而野生大豆共有6條酶帶。根據(jù)泳動(dòng)速率,酶譜可明顯分為2個(gè)部分,即慢區(qū)(S)和快區(qū)(F)。慢區(qū)Rf在0.021~0.277,快區(qū) Rf在 0.447~0.534(見(jiàn)表 1)。其中S1、S2為強(qiáng)帶,其余多為弱帶。S1、S2、S3、S5、S6、S7和F1、F2、F3為栽培大豆所有,S1、S2、S4、S6、S7和 F1為野大豆所有,即 S1、S2、S6、S7和 F1是大豆的特征譜帶,S4是野生大豆獨(dú)有的,而 S3、S5、F2、F3是栽培大豆獨(dú)有的譜帶。

    表1 過(guò)氧化物酶帶的遷移率

    圖1 野生大豆與栽培大豆過(guò)氧化物酶同工酶圖譜

    2.2 EST同工酶

    野生大豆與栽培大豆的酯酶同工酶譜見(jiàn)圖2。

    表2 酯酶帶的遷移率

    圖2 野生大豆與栽培大豆酯酶同工酶圖譜

    從圖2可以看出,野生大豆與栽培大豆的酯酶同工酶譜也存在不同。栽培大豆在慢區(qū)和快區(qū)各有2條 帶 , 分 別 為 S1、S2和 F1、F2。Rf值 分 別 為0.146,0.188,0.583和 0.646(見(jiàn)表 2),而野生大豆共有3條酶帶。S1、S2、F1為野生大豆和栽培大豆所共有的弱帶,F(xiàn)2是栽培大豆獨(dú)有的譜帶,而野生大豆沒(méi)有。

    2.3 基于同工酶酶譜的相似系數(shù)分析

    酶譜相似系數(shù)的大小表示品種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近。本實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)分析可得,野生大豆與栽培大豆過(guò)氧化物酶同工酶酶譜的相似系數(shù)為0.667,酯酶同工酶酶譜的相似系數(shù)為0.714。從這兩種酶譜分析來(lái)看,野生大豆與栽培大豆之間的親緣關(guān)系比較近。

    3 結(jié)論

    野生大豆和栽培大豆不僅在植物外部形態(tài)和生境上存在差別,而且同工酶酶譜也存在明顯差別。在本次實(shí)驗(yàn)中,野生大豆與栽培大豆過(guò)氧化物同工酶譜存在比較明顯的差異,酶帶分離效果較好。酯酶同工酶也存在區(qū)別,但效果不如過(guò)氧化物酶同工酶。過(guò)氧化物同工酶是由單基因決定的同工酶,它在一定程度上能較好的反映不同種源間的遺傳差異和親緣關(guān)系,而且利用其進(jìn)行物種的輔助鑒定,是一種較為方便、有效的手段。因此過(guò)氧化物酶同工酶譜可以作為野生大豆和栽培大豆進(jìn)化和類(lèi)型鑒定的參考依據(jù)。但遺傳差異不僅僅體現(xiàn)在一兩種酶上,如果能同時(shí)對(duì)更多的同工酶進(jìn)行分析,則更能全面的反映遺傳差異。

    野生大豆與栽培大豆的過(guò)氧化物酶和酯酶同工酶譜雖然都存在差異,但更多的是相似性,二者之間的酶譜相似系數(shù)說(shuō)明二者親緣關(guān)系較近,但也有各自的遺傳基礎(chǔ)。

    [1]林镕,俞德浚,吳征鎰,等.中國(guó)植物志[M].北京:科學(xué)出版社,2005.

    [2]Doyle J J,Doyle J L.Ribosomalgene variation in soybean(Glycine)and its relatives [J].Theoretical and Applied Genetics,1985,70(4):369-374.

    [3]於丙軍,羅慶云,曹愛(ài)忠,等.栽培大豆和野生大豆耐鹽性及離子效應(yīng)的比較[J]植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2001,101:25-29.

    [4]吳立新.野大豆栽培技術(shù)與利用[J].四川草原,2004,106(9):59-60.

    [5]周三,關(guān)崎春雄,岳旺,等.野生大豆、黑豆和大豆的異黃酮類(lèi)成分比較[J].2008,27(2):315-319.

    [6]李春梅,楊守萍,蓋鈞鎰,等.野生大豆與栽培大豆種子差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2007,34,(12):1296-1302.

    [7]劉潤(rùn)堂,賈煒瓏,溫琪汾,等.栽培大豆、野生大豆和半野生大豆酯酶同工酶的研究[J].山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1995,15(3):235-237.

    [8]趙洪錕,王玉民,李啟云,等.中國(guó)不同緯度野生大豆和栽培大豆 SSR 分析[J].大豆科學(xué),2001,20(3):172-176.

    [9]付暢,關(guān)旸,徐娜.鹽脅迫對(duì)野生和栽培大豆中抗氧化酶活性的影響[J].大豆科學(xué),2007,26(2):144-148.

    [10]於丙軍,羅慶云,曹愛(ài)忠.栽培大豆和野生大豆耐鹽性及離子效應(yīng)的比較[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào),2001,10(2):25-29.

    [11]劉海學(xué),王罡,季靜,劉鵬,等.16個(gè)向日葵品種過(guò)氧化物酶同工酶分析[J].中國(guó)油料作物學(xué)報(bào),2007,29(2):64-67.

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