白色念珠菌細胞壁不溶性β-葡聚糖抗腫瘤細胞的實驗研究

陶佳 崔進

惡性腫瘤是影響人類身心健康和引起人類疾病死亡的主要原因，目前治療惡性腫瘤的方法有消化道反應、造血功能抑制等明顯毒副作用，令患者痛苦，且治療不徹底，復發(fā)率高，因此開發(fā)高效低毒的抗腫瘤藥物具有必要性和重要性。白色念珠菌是一種條件致病性真菌［1］，其細胞壁的結(jié)構(gòu)似三明治-內(nèi)層為葡聚糖(glucan)，外層為甘露聚糖，其中葡聚糖和甘露糖蛋白至少占細胞壁干重的80%［2］，β-葡聚糖是白色念珠菌細胞壁含量最高的多糖。

本研究前期實驗已經(jīng)成功地從白色念珠菌細胞壁中提取出堿溶性β-葡聚糖(CABBG)、酸溶性β-葡聚糖(CAABG)，并分離出不溶性的β-葡聚糖［3］(CAIBG)，且急性毒性實驗研究結(jié)果顯示CAIBG比CAABG、CABBG的安全范圍更大，最值得進一步研究其藥效學作用。

本研究自制CAIBG，體外培養(yǎng)B16惡性黑色素瘤細胞、SGC-7901胃腺癌細胞和SMMC-7721肝癌細胞，觀察并結(jié)合MTT法檢測CAIBG對以上幾種腫瘤細胞生長的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 瘤細胞株 SGC-7901胃腺癌株、SMMC-7721肝癌株，由云南省天然藥物藥理重點實驗室提供;B16惡性黑色素瘤株從中國科學院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細胞庫處購買。

1.2 菌株 白色念珠菌-CJ(Candida albicans-CJ)，云南省天然藥物藥理重點實驗室保存菌株。

1.3 藥品與主要試劑 噻唑藍(MTT)為德州德藥制藥有限公司產(chǎn)品;a-淀粉酶為上海博奧生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;RPMI1640為GIBO公司產(chǎn)品;胎牛血清為杭州四季青生物公司產(chǎn)品。

1.4 主要儀器 發(fā)酵罐(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC，型號BIOFLO-410);CO2培養(yǎng)箱(日本 Olympus公司，型號BH2);酶聯(lián)免疫檢測儀(美國BIO-RAD公司，型號680)。

1.5 白色念珠菌的培養(yǎng) 按方法［4］共收集3000 g白色念珠菌菌體。

1.6 CAIBG的提取 按方法［5］獲得干燥粉末100 mg，放入4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 自制CAIBG劑型及給藥濃度 用電子天平準確稱取CAIBG粉末，溶于1%吐溫-80溶液中，0.2 μm微孔濾膜過濾后，即配制成不同濃度的溶液。

1.8 采用改良MTT法檢測CAIBG對癌細胞的體外抑制作用:常規(guī)培養(yǎng)B16惡性黑色素瘤細胞、SGC-7901胃腺癌細胞和SMMC-7721肝癌細胞至對數(shù)生長期后，用0.25%胰蛋白酶消化細胞，用含10%胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞以1×104細胞/孔的密度分別接種于3個96孔板，每孔加細胞懸液90μl，每個濃度設5個復孔，在37℃，100%相對濕度，含5%CO2的培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24 h。待細胞貼壁后，分別加入500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5 μg/ml、31.25 μg/ml 的多糖溶液、陰性對照劑生理鹽水和溶劑對照劑吐溫80各10μl。分別置37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后，加入MTT(5 mg/mL)10 μl繼續(xù)培養(yǎng)，4 h 后加入三聯(lián)液 100 μl，過夜，次晨在570 nm波長處用酶標儀測吸光度(A570)值。試驗重復三次，計算各組均值。根據(jù)以下公式計算出癌細胞生長抑制率:

癌細胞生長抑制率%=(1-實驗組平均A570值/對照組平均A570值)×100%

數(shù)據(jù)處理通常以T/C表示，T/C=100×OD值處理組/OD值對照組。通過回歸計算，求出T/C=50%的藥物濃度，即IC50值(半數(shù)抑制濃度)

1.9 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行多組間及組內(nèi)差異χ2檢驗，各組實驗的結(jié)果用抑癌率表示。

2 結(jié)果

2.1 CAIBG作用后腫瘤細胞的形態(tài)學變化(見圖1-圖4)，鏡下觀察:對照組細胞排列密集，細胞呈圓形，大小不一，核分裂相及瘤巨細胞多見。而加有CAIBG的B16惡性黑色素瘤細胞和SCG-7901胃癌細胞，排列稀疏，核分裂相減少，細胞呈多形性改變。CAIBG組和陰性對照組比較，SMMC-7721肝癌細胞形態(tài)沒有明顯變化。①B16惡性黑色素瘤細胞;②SCG-7901胃癌細胞。

圖1 陰性對照組48 h

圖2 CAIBG(500 μg/ml)48 h

圖3 陰性對照組48 h

圖4 CAIBG(31.25 μg/ml)48 h

2.2 CAIBG對體外培養(yǎng)B16惡性黑色素瘤細胞的生長抑制作用。

表1 CAIBG對體外培養(yǎng)B16惡性黑色素瘤細胞的生長抑制作用

CAIBG對體外培養(yǎng)的B16惡性黑色素瘤細胞增殖有抑制作用，與陰性組比較均有顯著差異(P＜0.01)。在CAIBG濃度達到 500μg/ml時抑制作用最強，抑制率最高達到42.8%;用軟件計算出CAIBG作用于B16惡性黑色素瘤細胞系的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為1.51 mg/ml。在各濃度作用點上，CAIBG對腫瘤細胞的抑制作用隨時間延長而趨于明顯(P＜0.05)。在相同時間點上，CAIBG對B16惡性黑色素瘤細胞的抑制作用隨濃度增加而增強。

2.3 CAIBG對體外培養(yǎng)胃癌SCG-7901細胞的生長抑制作用

表2 CAIBG對體外培養(yǎng)胃癌SCG-7901細胞的生長抑制作用

在CAIBG濃度達到31.25 μg/ml時抑制作用最強，抑制率最高達到59.88%;用軟件計算出CAIBG作用于SCG-7901胃癌細胞系的半數(shù)抑制濃度(IC50)約為0.43 mg/ml。在各濃度作用點上，CAIBG對腫瘤細胞的抑制作用隨時間延長而趨于明顯(P＜0.05)。在相同時間點上，CAIBG對SCG-7901胃癌細胞的抑制作用隨濃度增加而減弱。

3 討論

白色念珠菌作為一種條件致病真菌，關(guān)于它的研究一直以來大多是針對其預防，診斷和治療，研究其細胞壁多糖的在國內(nèi)外都不多見。以往研究證實不溶性β-葡聚糖具有免疫學活性［5，6］。

本研究為了探討CAIBG的體外抗腫瘤作用，用MTT法檢測各癌細胞株加入不同劑量CAIBG后的生長抑制率。結(jié)果證明，在沒有添加任何附加條件的前提下，受CAIBG作用的B16惡性黑色素瘤細胞和SGC-7901胃腺癌細胞，細胞排列稀疏，核分裂相減少，細胞呈多形性改變，與對照組比較細胞增生不活躍，形態(tài)學上證實了CAIBG具有體外直接抗腫瘤細胞增殖的作用。

不溶性的β-葡聚糖呈顆粒狀，易與受體結(jié)合，能激活相應的信號傳導途徑［7］。本實驗中，不能排除CAIBG直接與腫瘤細胞膜表面的受體結(jié)合，從而發(fā)揮體外直接抑制腫瘤細胞生長的可能性。許多研究證實了CR3是β-葡聚糖抗腫瘤受體基礎(chǔ)之一。屬于β-葡聚糖受體的CR3有兩個不同配體結(jié)合區(qū)域:I域作為iC3b的結(jié)合部位，與其結(jié)合，介導白細胞與NK細胞對iC3b調(diào)理的微生物或靶細胞的細胞毒功能;凝集素部位與β-葡聚糖特異性結(jié)合，激活巨噬細胞，繼而觸發(fā)對iC3b調(diào)理的腫瘤細胞的細胞毒反應［8］。Yan等［9］從 CR3受體水平對酵母β-葡聚糖抗腫瘤作用的研究揭示了β-葡聚糖通過作用于CR3受體介導的抗腫瘤效應，β-葡聚糖與CR3的凝集素結(jié)合部位結(jié)合后使巨噬細胞，NK細胞，中性粒細胞處于預激活狀態(tài)，通過iC3b作為樞紐，使效應細胞和靶細胞結(jié)合在一起，從而殺傷靶細胞，發(fā)揮細胞毒作用。

綜上所述，CAIBG可能通過與腫瘤細胞膜上的受體結(jié)合，改變腫瘤細胞的能量轉(zhuǎn)化或影響其細胞通道的開放而導致細胞代謝障礙，達到直接抑制腫瘤細胞生長的作用。值得進一步研究和探討CAIBG的體內(nèi)抗腫瘤作用及其機制，以及與化療藥物聯(lián)合應用的協(xié)同作用，具有廣闊的前景。

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