內(nèi)皮祖細(xì)胞捕獲支架防治犬肝靜脈再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究

王勇 張慶橋 祖茂衡 徐浩

肝靜脈狹窄或閉塞多見于肝移植術(shù)后和布加綜合征，肝移植術(shù)后肝靜脈狹窄的發(fā)生率達(dá)1%～4%[1]，布加綜合征血管成形術(shù)后再狹窄率高達(dá)10.3%[2,3]。目前，球囊擴(kuò)張和/或支架置入是主要治療方法，但術(shù)后肝靜脈反復(fù)再狹窄仍是尚未解決的問題。本研究將CD34抗體通過底物涂布于支架上，依據(jù)抗原-抗體結(jié)合原理，期望支架“自動(dòng)捕捉”血液中的EPCs，使之附著在支架表面上，分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞，促使支架表面迅速內(nèi)皮化，以達(dá)到預(yù)防支架置入后再狹窄的目的。

1 材料與方法

1.1 材料 金屬裸支架（沈陽永通醫(yī)療器械有限公司），引導(dǎo)鋼絲，8F鞘管，壓力泵，低分子右旋糖苷（六安華源制藥有限公司），聚明膠肽注射液（武漢華龍生物制藥有限公司）,CD34 抗體（南京博湃生物技術(shù)有限公司），青霉素，熒光顯微鏡,阿司匹林，光學(xué)顯微鏡，掃描電子顯微鏡

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的準(zhǔn)備 成年家狗24只，雌雄不限，每只體重22—25k g,由徐州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將24只家狗按隨機(jī)數(shù)字法分為實(shí)驗(yàn)組和對照組各12只，同時(shí)每組又分為2個(gè)亞組各6只，分別用于支架植入術(shù)后第1周和第8周取材檢測各項(xiàng)指標(biāo)。

1.2.2 包被支架的底物選擇 取10mm×30mm大小的支架一枚，縱向剖開、展平、分割成6等分小片段，放入75 的乙醇中浸泡24h，隨機(jī)分成2組，聚明膠肽組和低分子右旋糖苷組。取聚明膠肽和低分子右旋糖苷各40m l，盛于無菌容器中，置于無菌操作臺上。將分好組的支架片段取出自然晾干，然后浸入各自底物中20s，取出后用電吹風(fēng)吹干，如此反復(fù)5次。將包被好聚明膠肽和低分子右旋糖苷的支架片段分別浸入CD34抗體中，浸泡20s后取出，用電吹風(fēng)吹干，如此反復(fù)5次。將包被好抗體的支架片段分別放置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察比較，根據(jù)熒光的強(qiáng)度、密度及分布來比較兩種底物的吸附效果，結(jié)果顯示聚明膠肽的抗體吸附效果比低分子右旋糖苷效果好。

1.2.3 CD34抗體包被支架體外吸附內(nèi)皮祖細(xì)胞 利用密度梯度離心法分離培養(yǎng)家狗外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞，分別將包被好兩種底物及CD34抗體的支架浸泡在內(nèi)皮祖細(xì)胞懸液中，培養(yǎng)12h，在掃描電子顯微鏡下觀察支架表面吸附的內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量以及表面細(xì)胞分布密度。結(jié)果證實(shí)聚明膠肽作為支架底物效果優(yōu)于低分子右旋糖苷，故選擇聚明膠肽作為最終底物包被支架。

表1 支架置入后第8周兩組血管內(nèi)膜增生程度比較（ ）

1.2.4 支架的準(zhǔn)備及分組 取10mm×30mm大小規(guī)格完全相同的12個(gè)支架,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，每組6個(gè)支架。2組支架浸泡于75%乙醇中24h，取出支架自然晾干后，再將2組的支架浸泡于聚明膠肽中，浸泡20s后取出，使用電吹風(fēng)吹干，如此重復(fù)5次。將其中對照組包被好聚明膠肽的支架保存在無菌容器中，放置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆?。將?shí)驗(yàn)組支架浸泡于CD34抗體中，20s后取出，使用電吹風(fēng)吹干,反復(fù)5次，方法同前述。在熒光顯微鏡下觀察包被CD34抗體密度和分布情況。將包被有CD34抗體的支架保存在無菌容器中，放置于4℃的冰箱中保存。

1.2.5 肝靜脈支架置入術(shù) 將狗稱取體重后,肌肉注射(以下簡稱肌注)3 的戊巴比妥1m l/kg、阿托品5m g，仰臥位固定于血管造影床上。取右頸外側(cè)氣管旁，局部備皮，常規(guī)消毒鋪巾,采用外科手術(shù)方法分離暴露右頸靜脈，以18F穿刺針局部穿刺頸靜脈，插入導(dǎo)絲，引入4FCob ra導(dǎo)管,透視下將其尖端插入肝右靜脈,通過數(shù)字減影血管造影(DSA)了解肝靜脈走行，計(jì)算平均肝靜脈內(nèi)徑。然后更換J形硬導(dǎo)絲，更換8F鞘管，將支架置入肝右靜脈主干。隨后再次造影證實(shí)支架通暢情況，測定支架兩端及中間部位支架腔內(nèi)徑。實(shí)驗(yàn)組與對照組支架置入方法相同，但實(shí)驗(yàn)組置入CD34抗體包被支架，對照組則置入無抗體包被的支架。術(shù)畢結(jié)扎右頸靜脈，逐層縫合,常規(guī)消毒包扎。術(shù)后每只家犬肌注青霉素80萬U/d，連續(xù)3d；喂食阿司匹林100mg/d，術(shù)后一直服用。

1.2.6 肝靜脈造影復(fù)查 飼養(yǎng)至第8周的家狗處死前均要行肝靜脈DSA復(fù)查，以了解支架內(nèi)有無狹窄及狹窄程度。造影方法同前，造影后測定每一支架兩端及中間部位支架內(nèi)徑百分比，計(jì)算平均值及內(nèi)徑百分比，并與支架置入后當(dāng)時(shí)血管造影的結(jié)果進(jìn)行比較。

1.2.7 標(biāo)本采集及觀察指標(biāo) 第一批動(dòng)物與術(shù)后第1周行麻醉后，打開腹腔，沿下腔靜脈鈍性分離至肝靜脈入口，剝?nèi)ブ車谓M織，剪開支架，取部分支架內(nèi)組織（大小10mm×10mm）放入2.5 戊二醛固定液（0.1m o l/l，PBS配制）中保存，用于掃描電鏡觀察。第2批動(dòng)物于術(shù)后第8周先行肝靜脈造影復(fù)查，后打開腹腔，沿下腔靜脈鈍性分離至肝靜脈入口，局部灌注肝素生理鹽水100m l以沖洗管腔內(nèi)血液，連接壓力泵，再局部灌注10 的中性甲醛溶液20m l，確保血管取材至標(biāo)本制作過程中不發(fā)生變形。取臨近支架肝靜脈血管組織和距離支架1cm處血管組織放入10 的中性甲醛溶液中固定保存，用于光學(xué)顯微鏡（以下簡稱光鏡）觀察。

1.2.8 掃描電鏡觀察 取出血管組織，用PBS反復(fù)沖洗3次，1 鋨酸固定2h，PBS反復(fù)沖洗3次，用30 、50 、70 、80 、90 、100 酒精逐級梯度脫水，每次15m in；100%的叔丁醇置換兩次，每次15m in，利用臨界點(diǎn)干燥器將組織塊脫水干燥，用真空噴涂儀于組織表面噴涂，最后置于掃描電鏡下觀察。

1.2.9 光鏡觀察 將預(yù)先保存固定的血管組織進(jìn)行石蠟包埋和病理組織切片，每塊組織切片6張，H E染色。采用光鏡觀察組織病理形態(tài)學(xué)改變，并測定新生內(nèi)膜厚度、新生內(nèi)膜面積及狹窄百分面積。新生內(nèi)膜面積為原始管腔面積與狹窄管腔面積之差值，狹窄百分面積＝（1－狹窄管腔面積 原始管腔面積）×100%。原始管腔面積為臨近正常血管管腔面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 肝靜脈內(nèi)徑、新生內(nèi)膜厚度等數(shù)值變量組間比較采用t檢驗(yàn)，平均支架狹窄百分比，平均狹窄百分面積的組間比較采用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 聚明膠肽和低分子右旋糖苷包被支架的效果比較

2.1.1 抗體粘附效果比較

熒光顯微鏡下顯示聚明膠肽（圖1）的抗體粘附效果優(yōu)于低分子右旋糖苷（圖2）。

2.1.2 兩種底物包被的CD34支架體外吸附內(nèi)皮祖細(xì)胞情況比較

2種支架表面均有細(xì)胞吸附，聚明膠肽（圖3）的支架表面吸附的細(xì)胞數(shù)明顯多于低分子右旋糖苷（圖4）。

2.2 抗體支架預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的比較

2.2.1 血管造影結(jié)果比較：（1）兩組動(dòng)物支架置入前肝靜脈平均內(nèi)徑，實(shí)驗(yàn)組為（7.0±0.61）m m，對照組為（7.1±0.56）m m，經(jīng)t檢驗(yàn)，兩組動(dòng)物肝靜脈平均內(nèi)徑統(tǒng)計(jì)學(xué)上差異無意義（t＝1.32，P＞0.05）。（2）肝靜脈造影復(fù)查：支架置入后第8周，行肝靜脈造影復(fù)查，其結(jié)果與支架置入后即刻造影結(jié)果比較，實(shí)驗(yàn)組支架內(nèi)腔基本通暢或支架壁輕度增厚（圖5），對照組支架壁明顯增厚（圖6）。支架狹窄百分比范偉6%-36%，中位數(shù)23%；對照組均顯示支架不同程度狹窄，狹窄百分比范圍43%-87%，中位數(shù)60%。經(jīng)秩和檢驗(yàn)，兩組比較差異有顯著性意義（t＝20，P＜0.01）。

2.2.2 掃描電鏡結(jié)果比較：術(shù)后第1周，實(shí)驗(yàn)組（圖7）內(nèi)皮細(xì)胞形狀較規(guī)則，排列方向一致，對照組（圖8）支架腔面內(nèi)皮細(xì)胞稀疏，呈現(xiàn)不規(guī)則形，排列方向雜亂。

2.2.3 光鏡觀察結(jié)果比較：實(shí)驗(yàn)組支架端血管內(nèi)膜輕度增生（圖9），對照組支架端血管內(nèi)膜增生顯著（圖10）。兩組支架內(nèi)平均新生內(nèi)膜厚度、平均新生內(nèi)膜面積及平均狹窄百分面積測定比較，實(shí)驗(yàn)組內(nèi)膜增生程度明顯比對照組輕（表1）。

3 討論

血管內(nèi)膜的完整性是維持血管正常功能和結(jié)構(gòu)的重要條件，而內(nèi)膜完整性的缺失則是新生內(nèi)膜增厚的基礎(chǔ)。血管內(nèi)膜損傷后血管平滑肌細(xì)胞活化,從收縮型轉(zhuǎn)向合成型，引發(fā)VSM Cs 的增生遷移和基質(zhì)合成，導(dǎo)致管腔狹窄[4]。在人體外周循環(huán)中存在一定數(shù)量的EPCs，EPCs表面抗原有很多種，相對特異性的表達(dá)CD34抗原。本研究選擇特異性CD34抗體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)選擇性的捕捉EPC s，使之附著在支架表面上，分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，快速修復(fù)受損的血管內(nèi)膜增殖分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，使缺損的內(nèi)皮得到快速修復(fù)，有效地減少新生內(nèi)膜增生，從而達(dá)到預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的目的。

聚明膠肽能夠粘附CD34抗體，且具有良好的生物相容性，利于細(xì)胞的生長，以上生物學(xué)特性已得到證實(shí)[5]。本研究通過比較抗體包被支架表面抗體的熒光強(qiáng)度、密度、分布及支架體外吸附內(nèi)皮祖細(xì)胞的效果，證明聚明膠肽的效果明顯優(yōu)于低分子右旋糖苷，因此選用聚明膠肽作為最終的底物，進(jìn)行支架包被。支架選用不銹鋼肝靜脈支架，已有國內(nèi)學(xué)者做了不銹鋼支架表面抗體的固定及體外細(xì)胞相容性研究，本研究過程中也證實(shí)了此點(diǎn)。術(shù)后掃描電鏡觀察顯示，實(shí)驗(yàn)組支架腔面內(nèi)皮化程度明顯優(yōu)于對照組；血管造影復(fù)查顯示，實(shí)驗(yàn)組支架內(nèi)腔開通情況明顯優(yōu)于對照組，管腔狹窄百分比明顯低于對照組；光鏡檢查結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組平均新生內(nèi)膜厚度、平均新生內(nèi)膜面積、平均百分狹窄面積均顯著低于對照組。以上資料表明，EPCs捕獲支架可以促進(jìn)肝靜脈支架腔面的內(nèi)皮生長，促使支架表面迅速內(nèi)皮化，修復(fù)受損的血管內(nèi)膜，達(dá)到預(yù)防肝靜脈支架置入后再狹窄的目的。

目前對EPCs捕獲支架的研究主要在冠狀動(dòng)脈和頸動(dòng)脈[6,7]，EPC s捕獲支架能夠有效預(yù)防動(dòng)脈支架植入后再狹窄，尚未見到捕獲支架應(yīng)用于肝靜脈的研究報(bào)道。國內(nèi)進(jìn)行了局部轉(zhuǎn)染V EGF基因金屬支架預(yù)防肝靜脈再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究[8]，但仍不能完全解決再狹窄的問題。基金支架制作工序復(fù)雜，EPC s捕獲支架制作相對簡便，且同樣能達(dá)到預(yù)防支架內(nèi)再狹窄的目的。本研究的亮點(diǎn)在于首次將EPC s捕獲支架應(yīng)用于預(yù)防肝靜脈支架置入后再狹窄，對于預(yù)防肝靜脈支架置入后再狹窄提供了新的理論依據(jù)，但還需進(jìn)一步的臨床實(shí)踐檢驗(yàn)。

[1]Kubo T, Shibata T, Itoh K, et al. Outcome of Percutaneous Transhepatic Venoplasty for Hepatic Venous Outflow Obstruction after Living Donor Liver Transplantation. Radiology,2006,239(1): 285-290.

[2]祖茂衡.深入開展布－加綜合征的基礎(chǔ)研究(述評)[J].介入放射學(xué)雜志,2006,15(9): 513-514.

[3]顧玉明,祖茂衡,徐浩,等.500例Budd-Chairi綜合征介入治療并發(fā)癥分析[J].中華放射學(xué)雜志,2003,37(12): 1083-1086.

[4]董偉華.血管成形術(shù)后再狹窄的機(jī)理[J].國外醫(yī)學(xué)臨床放射學(xué)分冊,1997,20: 26-9.

[5]袁晉青,高潤霖,史瑞文,等.豬冠狀動(dòng)脈內(nèi)金屬支架蛋白涂層的生物相容性研究[J].中國循環(huán)雜志,1998,13(5):271-273.

[6]Aoki J,Serruys PW, van Beusekom H,etal. Endothelial progenitor cell capture by stents coated with antibody against CD34: the HEALING-FIM(Healthy Endothelial Accelerated Lining Inhibits Neointimal Grow th-First In Man) Registry. J Am Coll Cardiol, 2005,45(10):1574-9.

[7]Walter DH, Cejna M, Diaz-Sandoval L, et al. Local gene transfer of phVEGF-2 plasmid by gene-eluting stents: an alternative strategy for inhibition of restenosis. Circulation, 2004,110:36-45.

[8]陳曉明,李子俊,梁偉民,等.局部轉(zhuǎn)染血管內(nèi)皮生長因子基因預(yù)防肝靜脈支架再狹窄的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華放射學(xué)雜志,2003,37(1): 20-24.