高鉬低銅對(duì)小鼠腎臟結(jié)構(gòu)及其表達(dá)TNF-α蛋白的影響*

王宏偉,周變?nèi)A,張 樑,張 森,胡文發(fā),楊自軍

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471003)

高鉬低銅對(duì)小鼠腎臟結(jié)構(gòu)及其表達(dá)TNF-α蛋白的影響*

王宏偉,周變?nèi)A,張 樑,張 森,胡文發(fā),楊自軍

(河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河南洛陽(yáng) 471003)

為研究高鉬低銅對(duì)小鼠腎臟結(jié)構(gòu)及TNF-α蛋白表達(dá)的影響,選用80只雄性昆明種小鼠隨機(jī)分為4組,在飲水中添加不同濃度的鉬(600 mg/L)及銅(3mg/L),建立動(dòng)物模型。在試驗(yàn)處理第90天時(shí)采樣,研究高鉬低銅對(duì)小鼠腎臟組織病理學(xué)及TNF-α表達(dá)的影響。結(jié)果顯示,高鉬組小鼠腎臟組織腎小體聚集,部分腎小球發(fā)生萎縮,間質(zhì)中有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),有新月體出現(xiàn)。與對(duì)照組相比,高鉬組腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量上升15.60%(P＜0.01);與低銅組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量上升24.60%(P＜0.01);與高鉬組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量上升7.14%(P＜0.05)。表明高劑量鉬導(dǎo)致腎臟發(fā)生明顯的病理組織學(xué)損傷,顯著提高了小鼠腎臟TNF-α的表達(dá),低銅加劇了鉬的毒性作用。

鉬 ;銅;小鼠 ;腎臟 ;TNF-α

近年來(lái),隨著鉬礦業(yè)的快速發(fā)展及鉬作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn),鉬對(duì)人畜健康的影響也日益明顯。經(jīng)調(diào)查證實(shí),我國(guó)河南、陜西、山西、甘肅、江西等省鉬礦附近均存在不同程度的污染,尤其豫西地區(qū)鉬儲(chǔ)量極大,居亞洲第一位,世界第三位,礦區(qū)周圍環(huán)境中鉬含量,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他地區(qū)。這就為動(dòng)物通過(guò)采食、飲水等途徑引發(fā)鉬中毒提供了物質(zhì)基礎(chǔ),是動(dòng)物健康的嚴(yán)重潛在威脅[1-2]。

研究表明,鉬和銅之間在代謝上有明顯的頡頏作用。日糧中鉬含量過(guò)高,會(huì)使銅的利用率下降,導(dǎo)致機(jī)體繼發(fā)性銅缺乏[2-3]。也有觀點(diǎn)認(rèn)為鉬和銅之間又有協(xié)同作用,適量的銅是機(jī)體吸收鉬所必需的。本研究通過(guò)建立高鉬低銅小鼠動(dòng)物模型,研究高鉬低銅對(duì)小鼠腎臟組織病理學(xué)損傷及 TNF-α蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80只21日齡健康雄性昆明種小鼠,購(gòu)自于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑 鉬酸鈉(Na2MoO4?2H2O)為天津市化學(xué)試劑四廠產(chǎn)品;硫酸銅(CuSO4?5H2O)為北京化工廠產(chǎn)品;蘇木素為上?？笊锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品;伊紅為上海楷洋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;SABC免疫組化試劑盒為武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品;DBA顯色試劑盒為武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取80只雄性昆明種小鼠,隨機(jī)分為4組,在飼喂低鉬低銅飼料基礎(chǔ)上,通過(guò)在飲水中添加鉬與銅建立試驗(yàn)動(dòng)物模型(表1)。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Expe rimental design

1.2.2 樣品的采集與制片 在試驗(yàn)第90天,每組隨機(jī)取6只小鼠,迅速取左側(cè)腎臟組織后,放入40 mL/L多聚甲醛中固定 24 h。然后放入700 mL/L酒精中,酒精梯度脫水,二甲苯透明,常規(guī)石蠟包埋。

1.2.3 小鼠腎臟組織切片的制備及免疫組化實(shí)驗(yàn)利用蘇木精-伊紅染色技術(shù)對(duì)小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察。并利用SABC免疫組化試劑盒和DBA顯色試劑盒,對(duì)小鼠腎臟 TNF-α蛋白表達(dá)進(jìn)行觀察。采用Image-Proplus v.5.1圖像分析軟件(美國(guó)MC公司)處理數(shù)據(jù),對(duì) TNF-α的表達(dá)進(jìn)行光密度值相關(guān)分析,結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 SAS 9.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)處理,以P＜0.05和P＜0.01作為差異顯著性判定標(biāo)準(zhǔn)。測(cè)定結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 高鉬低銅對(duì)小鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響

對(duì)照組腎臟組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)比較清晰,腎小管上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常(圖1A)。

低銅組部分腎小管中出現(xiàn)透明管型;腎小體體積增大,細(xì)胞數(shù)量增多;腎小囊腔狹窄呈裂隙狀;腎間質(zhì)可見(jiàn)少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1B和圖1C)。

高鉬組腎小體聚集;部分腎小球萎縮;腎間質(zhì)可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn);腎小管腔內(nèi)出現(xiàn)蛋白管型和細(xì)胞分解產(chǎn)物聚集形成的顆粒管型;極少數(shù)腎小囊內(nèi)有新月體形成(圖1D～圖1F)。

高鉬低銅組腎臟組織的部分腎小體萎縮;腎小球和腎小囊發(fā)生粘連,整個(gè)腎小囊腔發(fā)生完全或部分閉塞;出現(xiàn)少量纖維性新月體(圖1G和圖1H)。

圖1 小鼠腎臟組織病理組織學(xué)觀察(400×)Fig.1 Histopathological observation in kidney of mice(400×)

2.2 高鉬低銅對(duì)小鼠腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量的影響

TNF-α為胞漿型表達(dá)的細(xì)胞因子,本試驗(yàn)采用過(guò)氧化物酶使底物發(fā)生反應(yīng),與反應(yīng)部位產(chǎn)生棕黃色顆粒狀產(chǎn)物,依據(jù)棕黃色顆粒的多少及染色深淺判定陽(yáng)性強(qiáng)度。由圖2A～圖2F可見(jiàn),對(duì)照組腎臟組織腎小管有特異性著色,形成弱陽(yáng)性著色帶;低銅組腎臟組織形成的著色帶較對(duì)照組顏色淺;高鉬組腎臟組織切片中,陽(yáng)性細(xì)胞胞漿可見(jiàn)散在分布的棕黃色顆粒,表達(dá)細(xì)胞多分布于腎小管部位;高鉬低銅組腎臟組織切片中,顏色加深的棕黃色顆粒彌漫性分布于腎小管部位。

與對(duì)照組相比,高鉬組腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量顯著上升15.60%(P＜0.01);與低銅組相比,高鉬低銅組腎臟 TNF-α蛋白表達(dá)量顯著上升24.60%(P＜0.01);與高鉬組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量顯著上升7.14%(P＜0.05)(圖3)。

圖2 小鼠腎臟組織免疫組化觀測(cè)(400×)Fig.2 Immunohistochemistry observation in kidney of mice(400×)

圖3 高鉬低銅對(duì)小鼠腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量的影響Fig.3 Effect of high molybdenum low copper on TNF-αexpression of kidney in mice

3 討論

腎臟是機(jī)體新陳代謝過(guò)程中所產(chǎn)生的各種代謝終產(chǎn)物和過(guò)剩物質(zhì)的主要排出器官之一。且腎臟產(chǎn)生的尿中所含的排泄物種類最多、量也最大,作為機(jī)體最重要的排泄器官,腎臟也是體內(nèi)藥物及毒物代謝和排泄的重要器官。微量元素鉬大多數(shù)以水溶性(主要是鉬酸鹽)在消化道內(nèi)被吸收,作為非反芻動(dòng)物的小鼠,鉬主要在小腸內(nèi)被吸收。吸收后的鉬隨血液循環(huán)可分布于動(dòng)物所有組織器官和體液中,其中以骨髓、腎臟及肝臟含量最高。當(dāng)機(jī)體攝入過(guò)多鉬時(shí),腎臟作為機(jī)體對(duì)鉬代謝的最主要器官將積聚大量的鉬,從而引起腎臟發(fā)生一系列病理變化,影響機(jī)體的各項(xiàng)生理功能,表現(xiàn)出相應(yīng)的癥狀。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),高劑量鉬導(dǎo)致腎臟組織發(fā)生明顯的組織形態(tài)學(xué)損傷,這可能是由于動(dòng)物機(jī)體內(nèi)鉬含量增加,導(dǎo)致黃嘌呤氧化酶(XO)活力的升高而在機(jī)體內(nèi)會(huì)生成大量的超氧化物如超氧陰離子自由基(O2-),同時(shí)XO還可促進(jìn)NO的大量生成等[4-5],氧自由基又會(huì)啟動(dòng)機(jī)體的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而損傷組織細(xì)胞及其大分子物質(zhì),這可能是鉬中毒的毒性機(jī)理之一[6];同時(shí)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),鉬攝入過(guò)量時(shí),與攝入正常劑量銅的小鼠相比,攝入低劑量的銅的小鼠的腎臟組織形態(tài)受到更加嚴(yán)重的損傷。原因之一可能為超氧化物歧化酶(SOD)能有效地清除氧自由基,從而抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng),并能穩(wěn)定細(xì)胞膜。當(dāng)機(jī)體內(nèi)銅減少時(shí),Cu-SOD活力將顯著下降,SOD對(duì)氧自由基的清除能力減弱[7]。

細(xì)胞因子在一定條件下可加重組織炎癥或免疫損傷,且 TNF-α在感染、組織損傷、炎癥、休克等方面起重要介導(dǎo)作用[8]。近年來(lái)還發(fā)現(xiàn)TNF-α在中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及許多生物因子誘導(dǎo)的組織損傷過(guò)程中也起重要作用[9]。吳小南等曾在慈菇對(duì)鎘致急性肝損傷過(guò)程中TNF-αmRNA表達(dá)的影響中報(bào)道,一次大劑量氯化鎘的腹腔注射可誘導(dǎo)肝臟組織TNF-α mRNA的表達(dá)顯著升高[10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,高鉬組腎臟 TNF-α蛋白表達(dá)量上升15.60%(P＜0.01);與低銅組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量上升24.60%(P＜0.01),說(shuō)明過(guò)量的鉬會(huì)導(dǎo)致腎臟組織TNF-α的表達(dá)發(fā)生極顯著的升高。與高鉬組相比,高鉬低銅組腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量上升7.14%(P＜0.05),說(shuō)明高劑量鉬作用下,缺銅導(dǎo)致TNF-α的表達(dá)量增加,加劇了高劑量鉬的毒性作用。

綜上所述,高劑量鉬可導(dǎo)致小鼠腎臟組織形態(tài)嚴(yán)重受損,缺銅后可加劇高劑量鉬對(duì)小鼠腎臟組織形態(tài)的損傷;高劑量鉬導(dǎo)致腎臟中TNF-α蛋白表達(dá)增強(qiáng),缺銅后使高劑量鉬引起的腎臟TNF-α蛋白表達(dá)量增強(qiáng)。

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Effect of High Molybdenum Low Copper on the Structure and TNF-αExpression of Kidney in Mice

WANG Hong-wei,ZHOU Bian-hua,ZHANG Liang,ZHANG Sen,HU Wen-fa,YANG Zi-jun

(College of Animal Science and Technology,Henan University of Science and Technology,Luoyang,Hehan,471003,China)

To investigate the effect of molybdenum or copper on the structure and TNF-αexpression of kidney in mice,eighty female Kunming mice were randomly divided into 4 groups.Animal models were established by adding molybdenum(600 mg/L)or copper(3 mg/L)into drinking water.On the 90thday,kidneys were collected to be researched.The results are as follows:In the high molybdenum group,the renal corpuscles closed together,some of them appeared adhesion,plenty of inflammatory cells infiltration,and a little of crescent were observed.Compare with the control group,the lever of TNF-αexpression were significantly increased by 15.60%in the HM group(P＜0.01),The lever of TNF-αexpression were significantly increased by 24.60%in the HMLC group(P＜0.01),compared with the control group.Compare with the HM group,the lever of TNF-αexpression increased by 7.14%in the HMLC group(P＜0.05).The results indicated that,excessive molybdenum induced sever damage in the kidney.The level of TNF-αexpression was obviously increased.Deficiency copper aggravated the molybdenum toxic action in kidney.

molybdenum;copper;mice;kidney;TNF-α

S859.8;S852.31

A

1007-5038(2010)09-0051-04

2010-06-25

河南科技大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(09001368);河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2010B230002)

王宏偉(1978-),男,山西朔州人,博士,主要從事動(dòng)物中毒病研究。