青霉素酶特異性抗血清間接ELISA方法的建立*

嚴(yán) 兵,彭開(kāi)松,薛秀恒,涂 健,王 強(qiáng),何東旭,祁克宗

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

青霉素酶特異性抗血清間接ELISA方法的建立*

嚴(yán) 兵,彭開(kāi)松,薛秀恒,涂 健,王 強(qiáng),何東旭,祁克宗*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,安徽合肥 230036)

以青霉素酶為抗原,免疫健康獺兔,自行制備青霉素酶特異性抗血清(PcAb),并建立間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的測(cè)定方法,優(yōu)化試驗(yàn)條件,測(cè)定制備的青霉素酶特異性抗血清效價(jià)。結(jié)果表面抗原最佳包被濃度為10 μg/mL,酶標(biāo)二抗最佳稀釋度為1∶2 000,陽(yáng)性血清最佳稀釋度為1∶2 000,抗原最佳包被條件為4℃過(guò)夜,血清最佳反應(yīng)時(shí)間為37℃1 h,酶標(biāo)二抗反應(yīng)最佳時(shí)間為37℃1 h,與底物作用的最佳時(shí)間為20 min。

青霉素酶;抗血清;間接ELISA

*通訊作者

β-內(nèi)酰胺酶(β-lactamase)是一類(lèi)由細(xì)菌產(chǎn)生的能夠降解β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素,使其抗菌作用減弱或消失的酶,是由多種酶組成的酶家族,俗稱(chēng)抗生素分解劑,又名解抗劑或金玉蘭酶制劑[1-2]。至今發(fā)現(xiàn)的β-內(nèi)酰胺酶的數(shù)量已超過(guò)190多種,主要為青霉素酶和頭孢菌素酶[3]。

青霉素作為β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物是治療奶牛乳腺炎的首選藥物,是牛奶中最常見(jiàn)的殘留抗生素。國(guó)內(nèi)大多數(shù)乳品企業(yè)出于經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)動(dòng),利用青霉素酶能選擇性分解牛奶中殘留的青霉素類(lèi)抗生素的特性,人為的添加青霉素酶而達(dá)到降低牛奶中青霉素類(lèi)抗生素的含量,生產(chǎn)人造“無(wú)抗奶”,但是由于該制劑的安全風(fēng)險(xiǎn)未知,為國(guó)家禁止使用的食品添加劑,目前國(guó)際和國(guó)內(nèi)均不允許該酶在牛奶中作為添加劑使用[4]。另一方面,β-內(nèi)酰胺酶的濫用也助長(zhǎng)了牛奶生產(chǎn)中β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的濫用,加速了耐藥菌的傳播,嚴(yán)重威脅人體健康和中國(guó)奶業(yè)的長(zhǎng)期發(fā)展[5-7]。因此,本研究建立的青霉素酶特異性抗血清間接ELISA檢測(cè)方法,對(duì)于我國(guó)奶制品安全監(jiān)測(cè)及保障我國(guó)奶業(yè)健康發(fā)展意義非常重大。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12只3月齡左右健康獺兔。

1.1.2 試劑 青霉素酶為日本東京仁成工業(yè)株式會(huì)社生產(chǎn);HRP-山羊抗兔IgG二抗為上海市生工生物工程公司產(chǎn)品;TMB購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;其他包被液、抗體稀釋液、底物液、終止液、封閉液均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物病理實(shí)驗(yàn)室自制。

1.1.3 儀器 318MC型酶標(biāo)儀為上海市三科儀器公司產(chǎn)品;SZ-1型快速混勻器為江蘇省金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品;96孔ELISA酶標(biāo)板為浙江省臺(tái)州市愛(ài)思進(jìn)公司產(chǎn)品;SZ-1型快速混勻器為江蘇省金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 青霉素酶特異性抗血清的制備

1.2.1.1制備青霉素酶佐劑苗 免疫前將10 mL弗氏完全佐劑和10 mL青霉素酶分別吸入兩個(gè)10 mL注射器內(nèi),然后插入三通管內(nèi),交替推動(dòng)針管、混勻,反復(fù)攪拌,直至形成黏稠的乳劑,滴于水上完全不擴(kuò)散為止。

1.2.1.2 免疫動(dòng)物 選擇12只、3月齡左右、健康、雄性、體重(2.0±0.5)kg的獺兔,隨機(jī)分為A、B、C 3組,每組4只。試驗(yàn)前進(jìn)行健康觀察和預(yù)飼養(yǎng)2周,免疫之前心臟采血,作為陰性血清對(duì)照。用上述制備的青霉素酶佐劑苗進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)免疫,首免用青霉素酶弗氏完全佐劑苗,加強(qiáng)免疫用青霉素酶弗氏不完全佐劑苗,每?jī)芍苊庖?次,每次免疫前心臟采血,離心分離血清。試驗(yàn)動(dòng)物具體免疫程序見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物免疫程序Table 1 The immune procedures of experimental animals

1.2.2 青霉素酶特異性抗血清間接ELISA方法

1.2.2.1 抗原最適包被濃度和酶標(biāo)二抗最適工作濃度的確定及間接ELISA法基本操作步驟 包被:用制備的抗原包被液(Na2CO31.5 g,NaHCO3 2.9 g,用水定容至1 000 mL,調(diào)節(jié)pH9.6)將青霉素酶按 40、20、10、5.0、2.5、1.25 μg/mL 6 個(gè)梯度倍比稀釋,每孔加100 μL包被 96孔酶標(biāo)板,4 ℃過(guò)夜;棄去孔內(nèi)液體,用制備的洗滌液(NaCl 8.0 g,KH2PO40.2 g,Na2HPO4?12H2O 2.9 g,KCl 0.2 g,Tween-20 0.5 mL,用水定容至1 000 mL,調(diào)節(jié)pH 至 7.4)洗滌 3次,3 min/次～5 min/次,甩液,用吸水紙拍干;封閉 :用 200 μL 的 20 mL/L 牛血清白蛋白于37℃封閉3 h;棄去孔內(nèi)液體,用洗滌液洗滌3次,3 min/次～5 min/次,甩液,用吸水紙拍干;加陽(yáng)性血清:青霉素酶特異性抗血清用制備的抗體稀釋液(NaCl 8.0 g,KH2PO40.2 g,Na2HPO4?12H2O 2.9 g,KCl 0.2 g,用水定容至 1 000 mL,調(diào)節(jié)pH 至 7.4)作 2 000倍稀釋,每孔加 100 μL,37℃孵育1 h,棄去孔內(nèi)液體,用洗滌液洗3次,3 min/次～5 min/次,甩液,用吸水紙拍干;加酶標(biāo)二抗:HRP-山羊抗兔IgG二抗用抗體稀釋液作1∶500、1∶1 000、1∶1 500、1∶2 000、1∶2 500、1∶3 000五個(gè)梯度稀釋,每孔加 100 μL,37 ℃孵育1 h,棄去孔內(nèi)液體,用洗滌液洗 3次,3 min/次～5 min/次,甩液,用吸水紙拍干;加底物溶液:每孔加100 μL制備的 TMB顯色液,置 37℃暗盒孵育20 min;加終止液 :用 100 μL 2 mol H2SO4中止反應(yīng),318MC型酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm處的OD值(OD492nm)。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照。

1.2.2.2 抗血清最適稀釋度的測(cè)定 分別將陽(yáng)性血清、陰性血清用抗體稀釋液作 1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000共 5個(gè)倍比稀釋。318MC型酶標(biāo)儀測(cè)定OD492nm值,計(jì)算P/N值。

1.2.2.3 抗原最佳包被條件的測(cè)定 按抗原包被條件分別為37℃1 h,37℃2 h 37℃4 h,4℃過(guò)夜,四種方式包被青霉素酶。318MC型酶標(biāo)儀測(cè)定

OD492nm值,計(jì)算P/N 值。

1.2.2.4 陽(yáng)性血清最佳反應(yīng)時(shí)間的測(cè)定 按血清反應(yīng)時(shí)間分別為0.5、1.0、1.5、2.0 h四種方式反應(yīng)。測(cè)定OD492nm值,計(jì)算P/N值。

1.2.2.5 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的測(cè)定 按酶標(biāo)二抗反應(yīng)時(shí)間分別為 0.5、1.0、1.5、2.0 h四種方式反應(yīng)。測(cè)定OD492nm值,計(jì)算P/N值。

1.2.2.6 底物溶液最佳顯色時(shí)間的測(cè)定 按底物溶液反應(yīng)時(shí)間分別為 10、15、20、25 min四種方式反應(yīng)。測(cè)定OD492nm值,計(jì)算P/N值。

2 結(jié)果

2.1 ELISA方陣試驗(yàn)及抗原最佳包被量的結(jié)果

抗原最佳包被量結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知,P/N≥2時(shí),且OD492nm值接近1時(shí),抗原最佳包被量為每孔加1.0 μg,即10 μg/mL。最佳酶標(biāo)二抗工作濃度1∶2 000。

表2 方陣滴點(diǎn)結(jié)果Table 2 The results of founder titration

2.2 血清最佳稀釋度的選擇

血清最佳稀釋度的結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,P/N≥2時(shí),且OD492nm值接近1時(shí),血清的最佳稀釋度為1∶2 000。

2.3 抗原最佳包被條件的選擇

抗原最佳包被條件見(jiàn)表4。由表4可知,P/N≥2時(shí),且OD492nm值接近1時(shí),抗原最佳包被條件為4℃過(guò)夜。

2.4 血清最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇

血清最佳反應(yīng)時(shí)間的結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知,P/N≥2時(shí),且OD492nm值接近1時(shí),血清最佳反應(yīng)時(shí)間為37℃1.0 h。

2.5 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇

酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知,P/N≥2時(shí),且OD492nm值接近1時(shí),酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間為37℃1.0 h。

2.6 底物溶液最佳顯色時(shí)間的選擇

底物最佳顯色時(shí)間的結(jié)果見(jiàn)表7。由表7可知,P/N≥2時(shí),且OD492nm值接近1時(shí),底物最佳顯色時(shí)間為25℃作用20 min。

2.7 抗血清效價(jià)檢測(cè)

抗血清效價(jià)檢測(cè)的結(jié)果見(jiàn)表8。由表8可知,三免、四免和五免的P/N值都大于2,可以判定為陽(yáng)性血清。

表3 血清最佳稀釋度的選擇Table 3 T he optimazation of seral dilutions

表4 抗原最佳包被條件的選擇Table 4 T he optimazation of covering antigen

表5 血清最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇Table 5 The optimazation of seral reaction time

表6 酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇Table 6 The optimazation of 2nd antibody

表7 底物溶液最佳顯色時(shí)間的選擇Table 7 The optimazation of the coloring time to substrate

表8 抗血清效價(jià)檢測(cè)結(jié)果Table8 T he detection result of seral titer

3 討論

青霉素酶是催化水解青霉素β-內(nèi)酰環(huán)產(chǎn)生青霉噻唑酸的一類(lèi)β-內(nèi)酰胺酶。在各種微生物中分布廣泛,特別在細(xì)菌中更為廣泛,但不同菌種的青霉素酶的活性相差較大。青霉素酶的分子質(zhì)量為28 ku～31 ku,由蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereus5/B與B.cereus569分別得到分子質(zhì)量為35 200 ku與31 500 ku的青霉素酶結(jié)晶,從巨大芽孢桿菌B.megaterium提取出α、β、γ青霉素酶結(jié)晶,隨后從不同細(xì)菌又分離出多種青霉素酶。該酶在pH(4～9.5)范圍內(nèi)穩(wěn)定,中性條件下,50℃時(shí)仍能保持酶活性。在臨床上,細(xì)菌由于產(chǎn)生青霉素酶而導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥性是最常見(jiàn)的機(jī)制。

檢測(cè)青霉素酶的可行方法主要有微生物培養(yǎng)法和碘量法[8]。微生物培養(yǎng)法:利用克拉維酸、舒巴坦的特異性抑制青霉素酶的特點(diǎn)做細(xì)菌培養(yǎng),通過(guò)測(cè)量抑菌圈得出結(jié)果。碘量法:利用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素的水解產(chǎn)物青霉噻唑酸與淀粉競(jìng)爭(zhēng)游離碘,通過(guò)觀察顏色可得出結(jié)果。碘量法雖然經(jīng)典、快速,但其試劑配制較復(fù)雜,淀粉試劑易失效,必須現(xiàn)配現(xiàn)用[9]。微生物法具有敏感、簡(jiǎn)單的特點(diǎn),但缺點(diǎn)是時(shí)間長(zhǎng),需過(guò)夜培養(yǎng),同時(shí)當(dāng)接種菌量少、血平板硬度大和藥物擴(kuò)散速度慢等因素時(shí),都會(huì)使此法的陽(yáng)性率偏低[10]。

本試驗(yàn)選擇青霉素酶為抗原,免疫健康試驗(yàn)獺兔,制備青霉素酶特異性抗血清,建立了間接ELISA法進(jìn)行青霉素酶的檢測(cè)方法。此方法采用抗原與抗體的特異性將待測(cè)物與酶連接,然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)來(lái)進(jìn)行定性或定量[11]。通過(guò)對(duì)抗原最佳包被量、最佳酶標(biāo)二抗工作濃度、血清最佳稀釋度、抗原最佳包被條件、血清最佳反應(yīng)時(shí)間、酶標(biāo)二抗最佳反應(yīng)時(shí)間和底物溶液最佳顯色時(shí)間條件的優(yōu)化,在此優(yōu)化條件下建立的ELISA法靈敏性高,可以在微克水平上進(jìn)行定量,具有高度的特異性,同時(shí)具有操作簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。ELISA法高度的靈敏性和特異性是微生物培養(yǎng)法和碘量法無(wú)法比擬的[12-13]。

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Establisment of Indirect ELISA for Special Serum of TEM

YAN Bing,PENG Kai-song,XUE Xiu-heng,T U Jian,WANG Qiang,HE Dong-xu,QI Ke-zong

(College of Animal Science,Anhui Agricultural University,Hefei,Anhui,230036;China)

To develop indirect ELISA for special serum of TEM,special sera of TEM were chosen and used to optimize the experiment conditions and evaluate the method.The results showed that the optimal prmordial covering concentration was 10 μg/mL,the optimal dilution of enzyme-labeled 2nd antibody was 1 ∶2 000,the optimal dilution of serum examined was 1∶2 000,the optimal prmordial covering condition was 4℃and one night,the optimal reaction time was 37℃and one hour,the optimal reaction time of enzyme-labeled 2nd antibody was 37℃and one hour,the optimal reaction time of substrate was twenty minutes.

TEM;anti-serum;indirect ELISA

S859.796

A

1007-5038(2010)09-0047-04

2010-03-19

“十一?五國(guó)家科技支撐計(jì)劃“課題”農(nóng)藥與獸藥殘留確證檢測(cè)技術(shù)研究”分課題(2006BAK02A08-4)

嚴(yán) 兵(1983-),男,安徽青陽(yáng)人,碩士研究生,主要從事動(dòng)物源性食品安全與控制研究。