復(fù)方中藥多糖對(duì)體外脾淋巴細(xì)胞增殖、NO生成和蛋白激酶G的影響

張 明

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系,山東菏澤 274015)

復(fù)方中藥多糖對(duì)體外脾淋巴細(xì)胞增殖、NO生成和蛋白激酶G的影響

張 明

(菏澤學(xué)院生命科學(xué)系,山東菏澤 274015)

將5種不同濃度復(fù)方中藥多糖(CPPS)加入到小鼠脾淋巴細(xì)胞中培養(yǎng)48 h,觀察CPPS對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖、對(duì)體外培養(yǎng)的脾淋巴細(xì)胞中NO的生成和蛋白激酶G(PKG)活性的影響。結(jié)果顯示,CPPS能顯著提高淋巴細(xì)胞增殖,顯著升高細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的生成,細(xì)胞內(nèi)PKG活性明顯提高,且CPPS、NO和PKG與淋巴細(xì)胞增殖有一定相關(guān)性。CPPS可能通過(guò)NO介導(dǎo)信號(hào)通路,引起第二信使環(huán)化鳥苷酸(cGMP)生成,從而提高PKG活性促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖,發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用。

復(fù)方中藥多糖;脾淋巴細(xì)胞增殖;一氧化氮;蛋白激酶G

淋巴細(xì)胞是執(zhí)行細(xì)胞免疫的主要細(xì)胞,受抗原物質(zhì)刺激后能分化增殖,發(fā)生特異性免疫應(yīng)答,產(chǎn)生抗體或淋巴因子[1]。一氧化氮(NO)是由一氧化氮合酶催化精氨酸與氧分子經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)而生成,在生物體內(nèi)是一種重要的信使分子和效應(yīng)分子[2]。在醫(yī)學(xué)界,通過(guò)測(cè)定 NO和一氧化氮合酶(NOS)來(lái)評(píng)價(jià)人類疾病發(fā)生、發(fā)展以及衡量免疫水平高低[3-7]。己有許多報(bào)道單一多糖可影響效應(yīng)細(xì)胞NO的合成,但對(duì)于中藥復(fù)方多糖對(duì)NO的合成和蛋白激酶G(PKG)活性的調(diào)節(jié)未見(jiàn)報(bào)道。一般認(rèn)為環(huán)化腺苷酸與環(huán)化鳥苷酸的含量與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)有關(guān),cGMP作為PKG的調(diào)節(jié)物催化其活性,cAMP作為具有抑制免疫的作用,cGMP具有增強(qiáng)免疫的作用。環(huán)化腺苷酸(cAMP)、環(huán)化鳥苷酸(cGMP)作為第二信使,是整體性調(diào)節(jié)機(jī)制影響細(xì)胞功能的中間樞紐。既可以維持神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的平衡,又可以使受破壞的網(wǎng)絡(luò)重新建立平衡,保證機(jī)體發(fā)揮正常的生理效應(yīng)。

本試驗(yàn)是在復(fù)方中藥多糖提取最佳工藝和最佳配方[8]的基礎(chǔ)上,采用噻唑藍(lán)(MT T)比色法測(cè)定CPPS對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖狀況,應(yīng)用硝酸還原酶法測(cè)定脾淋巴細(xì)胞NO生成,利用反向離子對(duì)高效色譜技術(shù)測(cè)定小鼠脾細(xì)胞PKG的活性,探討CPPS免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制,以期為開(kāi)發(fā)CPPS免疫增強(qiáng)劑及免疫保健品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 CPPS是由黃芪、人參、枸杞和當(dāng)歸中藥復(fù)方經(jīng)水溶醇沉法最佳工藝提取的復(fù)方多糖,多糖含量為47.12%,用不含小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液稀釋成 5 種濃度(μg/mL):400、200、100 、50、25以0.22 μ m濾膜過(guò)濾,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明種小鼠,體重18 g～22 g,購(gòu)于菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)室常規(guī)飼養(yǎng)7 d。

1.1.3 主要試劑和儀器 T ris,dithiothreitol(DT T)、histone、phenvlmethvl sulfonyl(PMSF)、GTP、phosphatidlserine(PS)、RPMI1640、DMSO、四甲基偶氮唑藍(lán)(M TT)和EGTA均為Sigma公司產(chǎn)品;EZ-Sep淋巴細(xì)胞分離液為達(dá)科為生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為日本卡特拉公司產(chǎn)品;CO2培養(yǎng)箱為美國(guó)Reveo公司產(chǎn)品;75-2A型微量振蕩器為上海醫(yī)用分析儀器廠生產(chǎn);恒溫培養(yǎng)箱為寧波江南儀器廠生產(chǎn);熒光倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus IX-50)為德國(guó)萊卡儀器廠生產(chǎn);高效液相色譜儀為Waers公司產(chǎn)品;NO、NOS試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 淋巴細(xì)胞增殖的測(cè)定 取3只小鼠,頸椎脫臼處死,無(wú)菌取出脾臟,用滅菌生理盆水沖洗3次,放入含Hank液洗滌,得淋巴分離液,分離淋巴細(xì)胞,分別向細(xì)胞懸液中加入刀豆蛋白A(ConA)(終濃度為 5 μg/mL)或脂多糖(LPS)(終濃度為10 μg/mL),然后加入到 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每100 μL,再分別加入各濃度的中藥多糖 100 μL,每種濃度重復(fù)4孔。另設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔,培養(yǎng)液調(diào)零孔。將細(xì)胞板放入體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2培養(yǎng)箱中37.5 ℃培養(yǎng)44 h,每孔加入20 μL MT T液,繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出,每孔吸出上清液,加入100 μL裂解液,在微量震蕩器上混勻,使其顏色變澄清,用酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)570 nm的吸光度(A570)作為淋巴細(xì)胞增殖的指標(biāo)。

1.2.2 淋巴細(xì)胞生成NO濃度的測(cè)定 分離淋巴細(xì)胞方法同1.4,用RPMI1640營(yíng)養(yǎng)液稀釋成5×106個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每孔 100 μL,再分別加入5種濃度的CPPS 100 μL,每種濃度重復(fù)6孔。同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔。將細(xì)胞板放入體積分?jǐn)?shù)為 5%CO2培養(yǎng)箱中,37.5℃培養(yǎng)48 h后取出,收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,測(cè)定NO的含量,測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明書。

1.2.3 脾臟淋巴細(xì)胞PKG的制備和活性測(cè)定

(1)細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理。調(diào)整脾臟淋巴細(xì)胞液濃度為6×106/mL,接種于96孔培養(yǎng)板中,試驗(yàn)組分別加入中藥復(fù)方多糖,使細(xì)胞懸液中中藥復(fù)方多糖的終濃度為 25、50、100、200、400 μg/mL;對(duì)照組加入同體積的1640培養(yǎng)液。置體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱,37℃培養(yǎng) 48 h后收集各組細(xì)胞,1 500 r/min,離心10 min,沉淀中加入PKG提取液0.5 mL/孔,于冰浴下超聲粉碎,得上清液即為胞漿和膜性組分,用于測(cè)定PKG的總活力。

(2)PKG活性測(cè)定。將PKG反應(yīng)液,30℃預(yù)熱5 min,再加入酶至反應(yīng)總體積為1.0 mL,30℃水浴搖床中準(zhǔn)確保溫10 min,立即置沸水浴1 min終止反應(yīng),冷卻后離心除去蛋白沉淀,上清液中加1 mL氯仿-甲醇(2∶1,V/V)混合液,振蕩1 min,以抽提脂溶性物質(zhì),再以2 000 r/min離心10 min,吸取水層,其中含有GTP、GDP和GMP。GTP含量用反相離子對(duì)高效液相色譜法測(cè)定。以底物GTP的消耗量來(lái)反映PKG的活性。一個(gè)酶活力單位相當(dāng)于每分鐘使組蛋白(hintone)磷酸化而消耗GTP 1.0 mmol所需的酶量。

2 結(jié)果

2.1 CPPS對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響

由表 1可知,CPPS在 50 μg/mL時(shí),CPPS+ConA組的A570值顯著高于ConA對(duì)照組(P＜0.05),而在 100 μg/mL 時(shí) ,CPPS+ConA 組的 A570值顯著高于ConA對(duì)照組(P＜0.01);CPPS在200、50 μg/mL CPPS+LPS 組的 A570值顯著高于LPS對(duì)照組 (P＜0.05)時(shí),而在 100 μg/mL時(shí),CPPS+LPS組的A570值極顯著高于LPS對(duì)照組(P＜0.01);在 100 μg/mL 和 50 μg/mL 時(shí),CPPS 組的A570值顯著高于細(xì)胞對(duì)照組(P＜0.05)。表明CPPS可以單獨(dú)或協(xié)同ConA和LPS促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,在100 μg/mL時(shí)效果最好。

表1 中藥復(fù)方多糖對(duì)淋巴細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of CPPS on lymphocyte proliferation on(A570)

2.2 CPPS對(duì)淋巴細(xì)胞NO生成、NOS酶活力的影響

由表2可知,在 50 μg/mL時(shí),NO濃度顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而在 100 μg/mL NO濃度極顯著高于對(duì)照組(P＜0.01),其他組無(wú)顯著差異;在50、100、200 μg/mL 時(shí) NOS 活力都顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)。表明CPPS在100 μg/mL時(shí) NO濃度和NOS活力效果最佳。

表2 中藥復(fù)方多糖對(duì)淋巴細(xì)胞分泌NO和NOS的影響Table 2 The effect of CPPS on NO and NOS

2.3 CPPS對(duì)淋巴細(xì)胞PKG活力的影響

由表3可知,CPPS除在 25 μg/mL外,在 50、200、400 μg/mL的PKG 活力顯著高于對(duì)照組(P＜0.05),而在 100 μg/mL時(shí),其 PKG 活力達(dá)到極顯著水平(P＜0.01)。

表3 中藥復(fù)方多糖對(duì)PKG的影響Table 3 The effect of CPPS on PKG

2.4 CPPS、NO、PKG及淋巴細(xì)胞增殖的相關(guān)性分析

由表4可知,CPPS與NO、PKG及淋巴細(xì)胞增殖的相關(guān)系數(shù)分別為0.921 8、0.879 3和0.832 2;NO與PKG和淋巴細(xì)胞增殖的相關(guān)系數(shù)分別為0.945 6、0.929 3,而 PKG與淋巴細(xì)胞增殖為0.895 6。表明CPPS對(duì)NO、PKG及淋巴細(xì)胞增殖的相關(guān)系數(shù)依次減少,而NO與PKG和淋巴細(xì)胞增殖相關(guān)系數(shù)分別為0.945 6、0.929 3。

表4 中藥復(fù)方多糖、NO、PKG和淋巴細(xì)胞增殖的相關(guān)性Table 4 The corelation of CPPS,NO,PKG and lymphocyte proliferation

3 討論

3.1 CPPS對(duì)體外培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞增殖的影響

淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo)。王遠(yuǎn)閣等[10]報(bào)道,黃芪多糖可顯著提高雞脾淋巴細(xì)胞增率。儲(chǔ)岳峰等[11]試驗(yàn)證實(shí),人參多糖和當(dāng)歸多糖均能單獨(dú)或協(xié)同ConA或LPS促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖。另?yè)?jù)報(bào)道,枸杞多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率達(dá)到顯著水平[12]。本試驗(yàn)中,CPPS在一定濃度下均能單獨(dú)或協(xié)同ConA或LPS促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖,且對(duì)體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的增殖作用具有一定的量效關(guān)系,CPPS 在 50、100、200 、400 μg/mL 達(dá)到顯著水平(P＜0.05),在100 μg/mL時(shí)刺激脾臟淋巴細(xì)胞增殖的作用最強(qiáng)(P＜0.01),從試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看,CPPS在適中濃度時(shí)淋巴細(xì)胞增殖達(dá)到最高,而在高濃度和低濃度時(shí)淋巴細(xì)胞增殖效果明顯降低,提示CPPS具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用,這種效果可能與其分子質(zhì)量大小、純度有關(guān),有待作進(jìn)一步研究。

3.2 CPPS對(duì)體外培養(yǎng)淋巴細(xì)胞NO合成和PKG活性的影響

NO作為細(xì)胞間及細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)物質(zhì),在機(jī)體的生理、病理和免疫過(guò)程中有重要的作用。胡庭俊等[13]在研究黃芪多糖對(duì)免疫信號(hào)相關(guān)分子的影響中發(fā)現(xiàn),黃芪多糖顯著提高NOS活性,從而提高NO水平,同時(shí)促進(jìn)PKG的活性。游育紅等[14]報(bào)道靈芝多糖顯著提高小鼠巨噬細(xì)胞中NO濃度的提高,從而達(dá)到非特異性免疫功能。白瑞江等[15]選擇cAMP、cGMP作為指標(biāo)來(lái)觀察香菇多糖在免疫調(diào)節(jié)中的作用,結(jié)果表明香菇多糖能增加小鼠血漿、脾臟及胸腺cGMP含量(P＜0.05);降低胸腺及脾臟cAMP含量(P＜0.05),可見(jiàn)香菇多糖對(duì)機(jī)體有免疫調(diào)節(jié)的作用。從本試驗(yàn)結(jié)果得知,CPPS可以激活體外培養(yǎng)的小鼠淋巴細(xì)胞表達(dá)NOS產(chǎn)生NO,且有一定的量效關(guān)系,CPPS在100 μg/mL刺激脾臟淋巴細(xì)胞分泌NO的作用最強(qiáng),且與促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的多糖濃度相關(guān)性達(dá)到0.921 8,提示CPPS能夠影響淋巴細(xì)胞NO的生成可能是其抗病毒和增強(qiáng)免疫作用的機(jī)制之一。CPPS可以激活體外培養(yǎng)的小鼠淋巴細(xì)胞PKG活性,且有一定的量效關(guān)系,CPPS在100 μg/mL PKG作用最強(qiáng),且與促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖的多糖濃度相關(guān)性達(dá)到0.879 3,NO與PKG和淋巴細(xì)胞增殖相關(guān)系數(shù)分別為0.945 6、0.929 3;PKG與淋巴細(xì)胞增殖的相關(guān)系數(shù)為0.895 6,從相關(guān)性分析來(lái)看,淋巴細(xì)胞增殖可能采取NO信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng),可能機(jī)制為:NO作用于環(huán)鳥苷酸酶,從而產(chǎn)生第二信使環(huán)化鳥苷酸(cGMP),環(huán)化鳥苷酸進(jìn)一步作用環(huán)化鳥苷酸依賴PKG,從而激活淋巴細(xì)胞增殖有關(guān)的酶或蛋白,從而促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖,其機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Effects of Compound Chinese Medicine Polysaccharides on Proliferation,NO Concentration and Protein Kinase G Activity in Lymphocyte

ZHANG Ming

(Li fe Science Department,Heze College,Heze,Shandong,274015,China)

T he CPPS with five different concentrations was co cultured for 48 hour with splenic lymphocyte.The effects of CPPS on splenic lymphocyte proliferation,NO concentration and protein kinase G activityin vitrowere observed.The results showed that the CPPS raised splenic lymphocyte proliferation,NO concentration and Protein kinase G activity significantly.In conclusion,the CPPS might perform its immunoregulation functions via signal transduction system in immunocytes by activating immunocytes to release NO and raise the activity of PKG.

compound Chinese medicine polysaccharide;splenic lymphocyte proliferation;NO;protein kinase G

S859.3

A

1007-5038(2010)09-0037-04

2010-03-22

山東省教育廳基金項(xiàng)目(J07WJ53)

張 明(1976-),男,黑龍江依蘭人,講師,碩士,主要從事中草藥活性成分研究。