豬偽狂犬病病毒gE抗體膠體金免疫層析檢測方法的建立及應(yīng)用*

廖文軍,吳健敏*,譚 攀,覃紹敏,陳鳳蓮,馬 玲,張 偉

(1.廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530001;2.深圳三方圓生物科技有限公司,廣東深圳 518102;3.廣西博白縣動物疾病預(yù)防控制中心,廣西博白 537600)

豬偽狂犬病病毒gE抗體膠體金免疫層析檢測方法的建立及應(yīng)用*

廖文軍1,吳健敏1*,譚 攀2,覃紹敏1,陳鳳蓮1,馬 玲1,張 偉3

(1.廣西獸醫(yī)研究所,廣西南寧 530001;2.深圳三方圓生物科技有限公司,廣東深圳 518102;3.廣西博白縣動物疾病預(yù)防控制中心,廣西博白 537600)

以純化的抗人紅細(xì)胞單鏈抗體(ScFv)-豬偽狂犬病病毒(PRV)gE蛋白雙功能融合蛋白為診斷抗原和膠體金標(biāo)記物,以羊抗豬IgG包被硝酸纖維膜作為質(zhì)控帶,制作檢測豬偽狂犬病毒gE抗體的雙抗原膠體金試紙條。利用方陣滴定試驗篩選出金標(biāo)抗原最佳工作濃度為17.6 μg,檢測線診斷抗原最佳標(biāo)記量為1.76 μg,血清最佳稀釋度為1∶10,作用時間15 min,與豬瘟病毒(CSFV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬乙型腦炎病毒(JEV)、豬布魯菌(Brucella)陽性血清和PRVgE缺失疫苗接種的豬免疫血清檢測線均不出現(xiàn)紅色條帶,與PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)檢測線出現(xiàn)紅色條帶。試紙條操作簡單,肉眼于15 min內(nèi)可判定結(jié)果;試紙條在室溫保存6個月,其特異性和敏感性沒有明顯變化;與美國IDEXX和法國LSI gE-ELISA抗體檢測診斷試劑盒檢測結(jié)果比較,1 164份豬血清的符合率均為90.55%。制備的膠體金試紙條具有操作簡便、敏感性和特異性較高的特點,可用于PRV野毒感染的快速篩查。

偽狂犬病毒;金標(biāo)免疫層析法;gE基因;抗體檢測

*通訊作者

豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus,PRV)引起的多種家畜、野生動物的一種以發(fā)熱、腦脊髓炎為主的急性傳染病[1]。豬是本病的主要宿主和帶毒者。通常引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)木乃伊胎、死胎和弱仔;初生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀,感染率和病死率可達(dá)100%,成年豬感染后多耐過,不發(fā)病但呈隱性感染,造成長期帶毒排毒,成為最危險的傳染源[2]。偽狂犬病(PR)一旦傳入豬群,將導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟損失,且很難根除[3]。目前診斷PRV常用的血清學(xué)方法有血清中和試驗(SNT)、乳膠凝集試驗(LAT)、瓊脂免疫擴散試驗(AGID)、血凝試驗(HA)與血凝抑制試驗(HI)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等[4],然而前面5種方法都無法區(qū)分野毒感染和疫苗免疫接種產(chǎn)生的抗體,ELISA雖可區(qū)分但操作需要專門的技術(shù)人員和分析儀器,不適合基層的使用。從廣西獸醫(yī)研究所畜禽診治中心調(diào)查的結(jié)果看,農(nóng)村散養(yǎng)戶及中小規(guī)模豬場PRV的發(fā)病率明顯高于大型養(yǎng)殖戶及管理條件好的養(yǎng)殖集團公司,而農(nóng)村中小規(guī)模豬場技術(shù)人員和設(shè)備又缺乏,無法利用ELISA等技術(shù)進(jìn)行PR的診斷,因此建立一種快速、直觀、簡便的PRV野毒感染診斷方法對基層養(yǎng)豬生產(chǎn)單位具有更為重要的意義。

免疫膠體金技術(shù)(immune colloidal gold technique,ICG)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種新型固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。它以膠體金為標(biāo)記物,利用特異性抗原抗體反應(yīng),通過帶顏色的膠體金顆粒來放大免疫反應(yīng)系統(tǒng),使反應(yīng)結(jié)果在固相載體上直接顯示出來,用于檢測待測樣品中的抗原或抗體[5]。目前國內(nèi)普遍用PRV gE基因缺失苗進(jìn)行免疫,gE基因是PRV的非必需基因,在被野毒感染的豬血清中能檢測到針對gE的抗體,這就為利用血清進(jìn)行PRV野毒感染豬和gE缺失疫苗免疫接種豬進(jìn)行鑒別診斷提供了條件[6]。本研究在成功利用抗人紅細(xì)胞單鏈抗體(ScFv)-偽狂犬病毒(PRV)gE蛋白雙功能融合蛋白2E8kgE[7]建立檢測PRV野毒感染的紅細(xì)胞凝集試驗[8]的基礎(chǔ)上,以純化的包含PRV gE蛋白的融合蛋白為抗原,采用雙抗原夾心法,利用免疫膠體金技術(shù)建立了檢測PRV野毒感染的診斷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 氯金酸(AuCl3HCl?4H2O)、檸檬酸三鈉(C6H5Na3O7?2H2O)、牛血清白蛋白(BSA)均為美國Sigma公司產(chǎn)品;硝酸纖維素膜(NC)、玻璃纖維濾紙及吸水材料膜均為Millipore公司產(chǎn)品,試紙條底板為上海醫(yī)藥工業(yè)研究院產(chǎn)品;HerdChek PRV gE-ELISA試劑盒為美國IDEXX公司生產(chǎn)(批號 09836-EE271);LSI PRV gE-ELISA試劑盒為法國LSI生產(chǎn)(批號5-AJGE-100);BioJet XYZ3000型點膜儀、CM4000試紙條切刀為美國BioDot公司產(chǎn)品;DV 730核酸蛋白分析儀為Beckman Coulter公司產(chǎn)品;常用化學(xué)試劑均為南寧(中國)生化藥品儀器公司分析純產(chǎn)品。

1.1.2 血清 CSFV 、PPV 、PRRSV 、JEV 、Brucellosis陽性血清,PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清,PRV gE缺失弱毒疫苗接種的免疫血清購自武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司。試驗用豬血清樣品采自省內(nèi)某些發(fā)病豬和基層送檢的豬血清。

1.2 方法

1.2.1 金標(biāo)免疫層析法抗原的制備 將抗人紅細(xì)胞H抗原單鏈抗體基因2E8[9]與PRVgE主要抗原編碼區(qū)基因[10]通過(SOE)PCR拼接成2E8kgE融合基因,并插入原核表達(dá)載體pET-T rx,構(gòu)建重組雙功能融合蛋白表達(dá)載體pET-Trx-2E8kgE[7]。將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌 BL21(DE3)PlysS,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)2E8kgE重組雙功能融合蛋白(簡稱重組蛋白),隨后以親和層析法對重組蛋白進(jìn)行純化,并以谷胱甘肽還原法進(jìn)行復(fù)性,經(jīng)透析、濃縮及紫外分光度計測定,該重組蛋白的濃度為1 760 μg/mL,作為金標(biāo)免疫層析法檢測用抗原。

1.2.2 膠體金的制備 按檸檬酸三鈉還原法[15]制備金溶膠:取 10 mL/L氯金酸1 mL加超純水至100 mL,所得氯金酸溶液濃度為0.1 mL/L,置于帶冷凝裝置的燒瓶中加熱至沸騰,磁力加熱攪拌下快速加入10 g/L檸檬酸三鈉水溶液2.8 mL,繼續(xù)加熱直至溶液呈葡萄酒色,無沉淀和漂浮物。膠體金顆粒經(jīng)紫外分光光度計測其520 nm處吸收峰,得到的顆粒直徑約為21 nm左右,冷卻后置于棕色瓶中,4℃冰箱保存。

1.2.3 重組蛋白與膠體金結(jié)合最佳pH的篩選取9個1.5 mL EP管,分別加入1 mL膠體金溶液;用0.1 mol/L K2CO3溶液將 pH分別調(diào)為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 、11.0;按 pH 從低到高分別取上述膠體金溶液各100 μL依次加入96孔板中,做 3次平行;每孔再分別加入 3 μL濃度為1 760 μg/mL的重組蛋白,混勻,靜止 5 min 后加入20 μL 濃度為100 g/L NaCl溶液,混合,室溫下放置10 min;觀察膠體金顏色變化,記錄2 h后仍保持紅色的pH。

1.2.4 蛋白與膠體金結(jié)合最佳工作量和檢測線診斷抗原量的確定 將濃度為1 760 μg/mL的重組蛋白用10 mL/L牛血清白蛋白依次作1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶100倍比稀釋(抗原含量分別為 880、352、176、88、58.7、44、35.2 、17.6 μg/mL),分別取 50 μL 稀釋后蛋白滴加于1 mL膠體金溶液中,同時分別取上述不同稀釋濃度蛋白各5 μL利用點膜儀噴于檢測線上,選用標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清來判定結(jié)果。

1.2.5 試紙條的組裝 如圖1所示,依次將包被的硝酸纖維素膜、金標(biāo)結(jié)合墊、樣品墊、吸水墊粘貼到底板上,分別在檢測線和質(zhì)控線上噴診斷抗原和羊抗豬IgG(噴涂量為 0.12 μg/mm),切割成0.4 cm×6 cm大小條帶,將切割好的試紙條裝入塑料卡內(nèi),使檢測線和質(zhì)控線均在檢測卡的結(jié)果區(qū)內(nèi),將檢測卡放入鋁箔袋中,袋中加包干燥劑,密封,常溫保存。

1.2.6 判定標(biāo)準(zhǔn)的設(shè)定 陽性:檢測線(test line)和質(zhì)控線(control line)均出現(xiàn)一條紫紅色帶,說明檢測樣品含有PRV gE抗體。陰性:檢測線(test line)不顯色,質(zhì)控線(control line)出現(xiàn)紫紅色線,說明樣品無PRV gE抗體;無效:只要質(zhì)控線(control line)不出現(xiàn)紫紅色線,說明本試紙已失效(圖2)。

1.2.7 膠體金試紙條特異性試驗 將CSFV、PPV 、PRRSV 、JEV 、Brucellosis陽性血清、PRV gE缺失疫苗免疫血清,以及 PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清取50 μL分別滴加于加樣孔中,觀察結(jié)果。

1.2.8 膠體金試紙條敏感性試驗以及最佳血清稀釋度的確定 將 PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清按 1∶10、1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640倍比稀釋,分別取 50 μL滴加膠體金加樣孔中,觀察結(jié)果;同時用美國IDEXX公司和 LSI公司生產(chǎn)的PRV gE-ELISA抗體檢測試劑盒檢測相同稀釋度的PRV陽性血清,以檢測膠體金試劑條的敏感性以及篩選出最佳血清稀釋度。

1.2.9 膠體金試紙條破壞性和穩(wěn)定性試驗 將膠體金試紙條放入55℃進(jìn)行破壞性試驗,放置14 d,每天分別取出10條膠體金試紙條進(jìn)行檢測,觀察結(jié)果;同時將試紙條置常溫下8個月,每月取出10條膠體金試紙條進(jìn)行檢測,觀察結(jié)果。

圖1 試紙條組裝示意圖Fig.1 The construction of colloidal gold strip

圖2 試紙條結(jié)果判斷示意圖Fig.2 Results of colloidal gold strip

1.2.10 PRVgE抗體檢測膠體金試紙條與 Herd-Chek和LSI PRV gE-ELISA試劑盒平行檢測試驗

按上述方法檢測1 164份豬血清,并用美國IDEXX公司和LSI公司生產(chǎn)的PRV gE-ELISA抗體檢測試劑盒同時進(jìn)行檢測,將上述三種檢測結(jié)果進(jìn)行比較,以檢測膠體金試紙條與進(jìn)口PRV gEELISA抗體檢測試劑盒檢測結(jié)果的符合率。進(jìn)口試劑盒操作步驟按說明進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白與膠體金結(jié)合最佳pH的篩選

通過上述的試驗表明,pH 為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0時膠體金出現(xiàn)凝集塊,而 pH 為9.0、10.0、11.0時,膠體金為穩(wěn)定的顆粒,說明膠體金與蛋白結(jié)合效果較好,遂選定pH 9.0為最佳標(biāo)記pH。

2.2 重組蛋白與膠體金結(jié)合最佳工作量的確定

通過方陣滴定試驗篩選出重組蛋白最佳抗原稀釋度為1∶5,對應(yīng)的蛋白量為 17.6 μg,檢測線診斷抗原稀釋度為1∶5,即包被量為1.76 μg(表1)。

2.3 膠體金試紙條特異性檢測

膠體金試劑條與 CSFV、PRRSV、PPV、JEV、Brucellosis陽性血清及PRV gE缺失疫苗免疫血清反應(yīng),檢測線均不出現(xiàn)紅色條帶,但與PRV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清產(chǎn)生很深的紅色條帶,說明膠體金試紙條具有較好的特異性(圖3)。

表1 金標(biāo)抗原和診斷抗原最佳稀釋度的方陣試驗結(jié)果Table 1 Results of antigen labeling colloidal gold strip and optimal dilution of diagnostic antigen by phalanx titration

圖3 膠體金試紙條特異性試驗Fig.3 Specificity test of colloidal gold strip

2.4 膠體金試紙條敏感性試驗

通過上述試驗,膠體金試劑條能檢出PRV陽性血清最大稀釋度為1∶80,HerdChek和 LSI PRV gE-ELISA試劑盒能檢出PRV陽性血清最大稀釋度分別為為1∶80和1∶160,說明PRV膠體金試紙條具有很好的敏感性,根據(jù)條帶的清晰度確定血清最佳稀釋度定為1∶10。

2.5 膠體金試紙條破壞性和穩(wěn)定性試驗

經(jīng)過55℃放置14 d,每天取出10條膠體金試紙條進(jìn)行檢測,結(jié)果試紙條質(zhì)控線、檢測線的顯色時間及顏色深淺和最終結(jié)果判讀均無明顯變化;放置常溫8個月每月取出10條膠體金試紙條進(jìn)行檢測其效果也沒有明顯的變化,將其保存期暫定為常溫6個月。

2.6 PRV gE抗體檢測膠體金試紙條與IDEXX和LSI PRV gE-ELISA試劑盒平行試驗

通過對臨床1 164份血清樣品進(jìn)行檢測,膠體金試紙條檢出陽性樣品115份,陽性率9.88%(115/1 164);陰性樣品 1 049份,陰性率90.12%(1 049/1 164);IDEXX和LSI PRV gE-ELISA試劑盒分別檢出陽性樣品5份,陽性率0.43%(5/1 164);陰性樣品1 159份,陰性率99.57%(1 159/1 164);膠體金試紙條與IDEXX和LSI PRV gE-ELISA試劑盒總符合率均為90.55%(1 054/1 164)(表2)。

表2 膠體金試紙條與IDEXX和LSI PRV gE-ELISA試劑盒檢測結(jié)果符合率Table 2 Detection results of the coincidence rate of colloidal gold strip among IDEXX and LSI PRV gE-ELISA kit

3 討論

近年來,偽狂犬病仍在我國豬群中廣泛流行,要想控制和消滅此病,僅靠使用疫苗免疫不能從根本上解決問題,通過野毒抗體水平監(jiān)測及時淘汰隱性感染豬,開展種豬PRV的凈化是解決問題的關(guān)鍵。因此,建立能有效區(qū)分野毒感染和疫苗免疫的鑒別診斷技術(shù)具有重要意義。盡管目前已經(jīng)建立了能夠區(qū)分PRV野毒感染的gE-ELISA檢測技術(shù),但由于它對酶標(biāo)儀及經(jīng)驗豐富操作人員的依賴,限制了該技術(shù)在臨床及廣大農(nóng)村養(yǎng)殖戶的使用,因此各國學(xué)者都在努力尋求一種簡便、快速、特異性高、敏感性好的診斷方法[2]。

免疫膠體金技術(shù)是 20世紀(jì)80年代繼熒光標(biāo)記、放射性同位素標(biāo)記和酶標(biāo)記三大標(biāo)記技術(shù)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。由于該方法具有快速、簡便、不需特殊設(shè)備、結(jié)果判斷直觀的特點,特別適合于現(xiàn)場快速檢測,目前已廣泛應(yīng)用于臨床診斷,尤其是在醫(yī)學(xué)臨床檢驗中已廣泛應(yīng)用,如早孕[11]、乙肝表面抗原[12]、腫瘤、寄生蟲[13]、病毒與細(xì)菌、藥物殘留、毒素等的檢測[14]。本研究采用膠體金標(biāo)記包含PRV gE蛋白的融合蛋白,制備膠體金免疫層析試紙條,以期尋找出一種費用低、靈敏度高、速度快、使用便捷的檢測PRV野毒抗體的方法。

從試驗結(jié)果來看,本試驗研制的膠體金試紙條具有較好的特異性、敏感性及穩(wěn)定性。從田間試驗結(jié)果來看,利用本試紙條與國外進(jìn)口試劑盒對臨床上1 164份血清樣品進(jìn)行檢測,總符合率為90.55%,膠體金試紙條檢測的陽性樣品中仍有一定的假陽性,究其原因可能有二:其一標(biāo)記物工作濃度可能過高,使非特異反應(yīng)增強;另一方面估計與本試驗檢測用抗原為大腸埃希菌原核表達(dá)產(chǎn)品,形成的包涵體需經(jīng)變性、復(fù)性及純化過程,影響重組蛋白的生物學(xué)活性有關(guān)。因此下一步工作是進(jìn)一步尋找標(biāo)記物的最佳工作濃度,同時研究重組蛋白的可溶性表達(dá),力爭進(jìn)一步提高本試紙條的特異性。但總的來看,本試驗研制的膠體金試紙條具有操作方便,價格低廉,敏感性強的特點,可作為PRV凈化實施中野毒抗體的初篩選,對檢出的陽性樣品再用其他試劑盒進(jìn)行復(fù)核,這將大大降低成本,在獸醫(yī)臨床的檢測上具有很好的應(yīng)用前景。

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Establishement and Application of Colloidal Gold Immunochromatographic Assay for Antibodies of gE of Pseudorabies Virus in Swine

LIAO Wen-jun1,WU Jian-min1,TAN Pan2,QIN Shao-min1,CHEN Feng-lian1,MA Ling1,ZHANG Wei3

(1.Guangxi Veterinary Research Institute,Nanning,Guang xi,530001,China;
2.Shenzhen Triphil Biotech Co.L TD,Shenzhen,Guangzhou,518102,China;
3.Bobai Center f or Animal Disease Control and Prevention,Bobai,Guangxi,537600,China)

An immunochromatographic strip with double-antigen colloidal gold for detecting the antidody of gE protein of pseudorabies virus in swine was prepared.The purified anti-human erythrocyte single chain fragment variable-pseudorabies virus gE bifunctional fusion protein labeled with colloidal gold used as the diagnostic antigen and a goat-anti-pig antidody was used on the control line of the nitrocellulose membrane while blotting the fusion protein on the test line.Through Phalanx titration,a double antigen was screened out,in which the optimal working concentration of the colloidal gold-labeled antigen was 17.6 μg,the optimal label amount of the diagnostic antigen on the test line was 1.76 μg,and the optimal dilution of serum was 1∶10 with a reaction time of 15 min.No red strips were displayed on the test line while detected with positive sera of classical swine fever virus(CSFV),porcine parvovirus virus(PPV),porcine reproduction and respiratory syndrome virus(PRRSV),Japanese encephalitis virus(JEV),Brucellaand serum of swine inoculated with PRV gE deleted vaccines,but the reaction of the double antigen with PRV standard positive serum was positive.The results demonstrated that the operation of this immunochromatographic strip is simple and the results can be judged with naked eyes with in 15 min;storage of the strips at room temperature for six months has not changed their sensitivity and specificity.Compared with the results from the American IDEXX and the French LSI gE ELISA antibody detection kits,the total coincidence rate of the negative and positive reaction reached 90.55%.These results suggested that the established colloidal gold immunochromatography assay can be used to detect the porcine serum antibodies of gE protein field PRV with the advantages of simple operation,high sensibility and specificity.

Pseudorabies virus;colloidal gold immunochromatographic assay;gE gene;antibody detection

S858.28;S852.659.1

A

1007-5038(2010)09-0012-06

2010-02-06

廣西科技攻關(guān)項目(桂科攻0537008-3A3;桂科攻0632002-1-2)

廖文軍(1983-),男,湖北仙桃人,實習(xí)研究員,碩士,主要從事分子免疫學(xué)與傳染病學(xué)研究。