細(xì)胞松弛素B對玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞的影響*

郭 娟,王志琴,趙云程,林嘉鵬,黃俊成*

(1.新疆畜牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)部家畜繁育生物技術(shù)重點開放實驗室,新疆烏魯木齊 830000;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

細(xì)胞松弛素B對玻璃化冷凍牛卵母細(xì)胞的影響*

郭 娟1,2,王志琴2,趙云程1,林嘉鵬1,黃俊成1*

(1.新疆畜牧科學(xué)院農(nóng)業(yè)部家畜繁育生物技術(shù)重點開放實驗室,新疆烏魯木齊 830000;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動醫(yī)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

用不同濃度細(xì)胞松弛素B(CB)預(yù)處理體外成熟牛卵母細(xì)胞,以固體表面玻璃化(SSV)法冷凍解凍后的存活率和孤雌激活發(fā)育能力作為評價指標(biāo),探討CB對體外成熟牛卵母細(xì)胞冷凍保存的影響。結(jié)果顯示,存活率方面,各濃度CB處理組與對照組無顯著差異(P＞0.05);激活后卵裂率方面,20 μ g/mL CB處理組顯著高于對照組(47.67%和30.25%,P＜0.05);囊胚率方面,20 μ g/mL CB處理組極顯著高于對照組(9.00%和1.75%,P≤0.01),同時還顯著高于其他4個處理組(P＜0.05)。研究表明,CB在玻璃化冷凍過程中的保護(hù)作用存在一定濃度的依賴性,其中用20 μ g/mL CB濃度處理最適于牛成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的改善。

卵母細(xì)胞;玻璃化冷凍;牛;細(xì)胞松弛素B

隨著胚胎工程技術(shù)逐步應(yīng)用于家畜繁殖和育種領(lǐng)域并形成產(chǎn)業(yè)化,卵母細(xì)胞的來源是制約其發(fā)展的重要因素,卵母細(xì)胞超低溫冷凍保存則是把這些技術(shù)發(fā)展到應(yīng)用階段不可缺少的一個重要技術(shù)手段。

自1985年Rall W F等[1]首次應(yīng)用玻璃化法對小鼠胚胎冷凍保存成功以來,由于其比傳統(tǒng)程序化冷凍方法具有無需儀器設(shè)備、操作簡便省時、適用范圍廣和冷凍效果好等優(yōu)點,便很快應(yīng)用于卵母細(xì)胞冷凍保存的研究中。但高濃度的玻璃化液也會對卵母細(xì)胞造成嚴(yán)重?fù)p傷,影響冷凍效果,于是人們通過尋找容易實現(xiàn)玻璃化并且對卵母細(xì)胞損傷較小的玻璃化液,以及大幅度提高冷凍速率而進(jìn)一步減少冷凍對卵母細(xì)胞的損害。在此期間,多種玻璃化冷凍方法應(yīng)運而生,如開放式拉長塑料細(xì)管法(open pulled straw,OPS)、固體表面玻璃化法(solid surface vitrification,SSV)和玻璃微細(xì)管法(glass micropipette,GMP)等都取得了一定的冷凍保護(hù)效果。目前,僅小鼠成熟卵母細(xì)胞的冷凍保存技術(shù)已趨為完善。家畜中,雖然牛卵母細(xì)胞冷凍保存研究最多,但只獲得了極少數(shù)來自冷凍牛GV期[2]和體外成熟卵母細(xì)胞[3]的牛犢,其冷凍卵母細(xì)胞的成熟率、受精率和發(fā)育率與未冷凍卵母細(xì)胞相比都還很低。

細(xì)胞松弛素B(cytochalasin-B,CB)是一種細(xì)胞骨架穩(wěn)定劑,能增加細(xì)胞骨架的彈性,降低卵母細(xì)胞和胚胎在凍融過程中由于細(xì)胞骨架變硬而引起的骨架變形和損傷[4-6]。CB在卵母細(xì)胞玻璃化冷凍過程中應(yīng)用的報道還比較少,國外在豬卵母細(xì)胞上的研究較多,指出其對豬卵母細(xì)胞具有一定的影響作用。但在更有經(jīng)濟(jì)價值的牛卵母細(xì)胞上,目前國內(nèi)外僅見Vieira A D等[7]和卞桂華等[8]的報道。為此,本試驗開展了CB預(yù)處理對牛成熟卵母細(xì)胞SSV玻璃化冷凍效果的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

卵巢采自新疆烏魯木齊市天鷹屠宰場,精液是由新疆維吾爾自治區(qū)畜禽改良總站提供的細(xì)管凍精。所用試劑除TCM199(Gbico),FBS(Hyclone),BSA(Bovogen)和 MEN NEAA(Gbico)外,其余均為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng) 從屠宰場收集成年母牛的卵巢,放入裝有30℃～35℃滅菌生理鹽水(含青、鏈霉素各100單位/mL)的保溫瓶中,2 h內(nèi)帶回實驗室。卵巢用38.5℃滅菌生理鹽水沖洗3次,用10 mL一次性注射器從卵巢表面上直徑為2 mm～8 mm卵泡內(nèi)抽取卵母細(xì)胞。在體視鏡下挑出卵丘細(xì)胞完整、卵母細(xì)胞胞質(zhì)均勻的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs),先用洗卵液(Hepes-M199+1 mg/mL PVA+雙抗)清洗2遍,再用成熟培養(yǎng)液(TCMI99+100 mL/L FBS+0.05 IU/mL FSH+0.05 IU/mL LH+1 μ g/mL E2)洗 3 次,最后將 50枚COCs吸入含0.5 mL成熟液的四孔培養(yǎng)板中,置38.5℃含體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。洗卵液、成熟液均預(yù)先在CO2培養(yǎng)箱平衡約2 h。

1.2.2 玻璃化冷凍程序 本試驗采用SSV法進(jìn)行玻璃化冷凍[9]。所有步驟在39℃下進(jìn)行,具體方法如下:卵母細(xì)胞去掉部分卵丘細(xì)胞,置于基礎(chǔ)冷凍液(HM)中 20 min(基礎(chǔ)冷凍液由 Hepes-M199和200 mL/L FBS組成);將5枚～6枚卵母細(xì)胞置于含100 mL/L二甲基亞砜(DMSO)+100 mL/L乙二醇(EG)的 HM 液(VS1)中 1 min,移入含有200 mL/L DMSO+200 mL/L EG的HM液(VS2)中,在30 s內(nèi),將含有5枚～6枚卵母細(xì)胞和1 μ L～2 μ L的VS 2滴入提前浸入液氮的金屬表面上,迅速冷凍,用鑷子將冷凍的卵母細(xì)胞移入凍存管中,凍存于液氮中(1 d或1個月)。

圖1 牛MⅡ卵母細(xì)胞解凍后胞質(zhì)萎縮(100×)Fig.1 Ooplasm atrophy of bovine MⅡoocytes after thawing(100×)

解凍時將冷凍的卵母細(xì)胞在含0.25 mol/L蔗糖的HM液中停留1 min,然后移入含0.15 mol/L蔗糖的HM液中停留5 min。

1.2.3 復(fù)蘇后卵母細(xì)胞存活評定 凍融后的卵母細(xì)胞在成熟液中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,觀察其存活情況。存活的卵母細(xì)胞與未經(jīng)冷凍的卵母細(xì)胞在形態(tài)上沒有差別,如有完整透明帶和細(xì)胞膜,且胞質(zhì)折光性好則判定為存活;如透明帶破裂、脫落、細(xì)胞質(zhì)碎裂、細(xì)胞萎縮均視為異常(圖1～圖4)。

圖2 牛MⅡ卵母細(xì)胞解凍后透明帶破損(200×)Fig.2 Zona pellucide of disrepair bovine MⅡoocytes after thawing(200×)

圖3 牛MⅡ卵母細(xì)胞解凍后胞質(zhì)溢出(100×)Fig.3 Ooplasm spill bovine MⅡoocytes after thawing(100×)

圖4 解凍后形態(tài)正常牛MⅡ卵母細(xì)胞(100×)Fig.4 Morphologically normal bovine MⅡoocytes after hawing(100×)

1.2.4 卵母細(xì)胞的孤雌激活 成熟卵母細(xì)胞用5 mg/L透明質(zhì)酸酶消化卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體,得到裸卵 ,放入離子霉素(5 μ mol/L)中處理 5 min,然后移入已平衡好2 mmol/L 6-DMAP液中,在CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。

1.2.5 胚胎體外培養(yǎng) 孤雌激活后的卵母細(xì)胞移入SOFaa培養(yǎng)液(50 μ L/滴,20 ～25枚/滴),置培養(yǎng)箱中進(jìn)行體外發(fā)育培養(yǎng)。于激活后48 h后統(tǒng)計卵裂率,并換SOFaa+100 mL/L FBS共培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)至第7天～第 8天統(tǒng)計囊胚率(圖5,圖6)。

圖5 牛MⅡ卵母細(xì)胞解凍后孤雌激活胚胎(100×)Fig.5 Embryo from vitrified-thawed bovine MⅡoocytes after activation(100×)

圖6 牛M Ⅱ卵母細(xì)胞解凍后孤雌激活囊胚(100×)Fig.6 Blastocyst from vitrified-thawed bovine MⅡoocytes after activation(100×)

1.2.6 統(tǒng)計分析 試驗所得數(shù)據(jù)采用SPSS 10.0軟件進(jìn)行差異顯著性統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度細(xì)胞松弛素B預(yù)處理對牛成熟卵母細(xì)胞冷凍后存活率的影響

CB預(yù)處理濃度分別為 2.5、7.5、10、20 和30 μ g/mL。將挑選的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為6組,第 1組卵母細(xì)胞直接冷凍作為對照組(即0組),其余5組用不同濃度CB處理30 min后,按照SSV玻璃化冷凍的方法處理卵母細(xì)胞,試驗結(jié)果見表1。從所示數(shù)據(jù)可以看出,20 μ g/mL CB組的存活率相對較高,但經(jīng)過統(tǒng)計分析表明,5個處理組的存活率與對照組之間都無顯著差異(P＞0.05)。這表明試驗中所用各濃度CB均對玻璃化冷凍的牛成熟卵母細(xì)胞存活沒有明顯的改善作用和毒副作用。

表1 不同濃度CB對牛成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍存活率的影響(n=3)Table 1 Effects of survival rate of vitrified bovine matured oocytes treated with CB in different concentrations

2.2 不同濃度細(xì)胞松弛素B預(yù)處理對牛成熟卵母細(xì)胞冷凍后孤雌激活后期發(fā)育能力的影響

凍融后用離子霉素和6-DMAP進(jìn)行化學(xué)激活(表2)?？梢钥闯?在卵裂率方面,5個處理組中20 μ g/mL CB組的卵裂率顯著高于對照組(P＜0.05),且它與 10 μ g/mL CB 組和30 μ g/mL CB 組相比差異顯著(P＜0.05);在囊胚率方面,20 μ g/mL CB組極顯著高于對照組(P＜0.01),同時它還顯著高于其它4個處理組(P＜0.05)。表明一定濃度的CB處理對冷凍后卵母細(xì)胞的后期發(fā)育能力有較大影響。

表2 不同濃度CB對牛成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍發(fā)育能力的影響(n=3)Table 2 Effects on development capability of vitrified bovine matured oocytes treated with CB in different concentrations

3 討論

3.1 細(xì)胞松弛素B對卵母細(xì)胞玻璃化冷凍存活率的影響

本試驗中,以10倍遞增方式增設(shè)了3個處理組。其中SSV玻璃化凍融后存活率結(jié)果顯示,5個處理組的存活率與對照組差異均不顯著(P＞0.05)。這一結(jié)果與Legal F L[10]和Fujihira T等[11]在山羊和豬中的報道有所不同,Legal F L[10]認(rèn)為,使用CB處理可提高山羊未成熟卵母細(xì)胞冷凍保存后的存活率。Fujihira T 等[11]報道,用7.5 μ g/mL CB 處理 30 min或5.0 μ g/mL CB處理10 min～30 min可以增加豬未成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍后的存活率,并指出細(xì)胞松弛素作為細(xì)胞骨架松弛劑可以減弱細(xì)胞骨架基礎(chǔ)的堅固性。這可能與卵母細(xì)胞的發(fā)育階段和種間差異有關(guān)。

3.2 細(xì)胞松弛素B對卵母細(xì)胞玻璃化冷凍發(fā)育能力的影響

卵母細(xì)胞在冷凍保存中引起發(fā)育潛力降低是必然的,這主要是由于冷凍過程中滲透壓的變化會改變細(xì)胞骨架成分的理化特性和完整性,導(dǎo)致減數(shù)分裂進(jìn)程異常和胚胎發(fā)育延遲[4-5,12],同時細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)濃度的增加也會使細(xì)胞膜損傷,進(jìn)而影響復(fù)蘇后卵母細(xì)胞的受精率[12,14-15]。CB是微絲抑制劑,在冷凍MⅡ期卵母細(xì)胞時能減弱對微管的損害并可能增加紡錘體微管的穩(wěn)定性[4,11]。當(dāng)前,CB在不同種間卵母細(xì)胞玻璃化冷凍過程中的保護(hù)作用存在很大差異。在國外,Isachenko V等[6]報道,玻璃化冷凍豬GV期卵母細(xì)胞前用7.5 μ g/mL CB處理,解凍后卵母細(xì)胞成熟率為22.0%,而對照組僅為5.6%。Dobrinsky J R等[4]報道,超低溫冷凍保存擾亂了胚胎細(xì)胞膜和微絲的有序結(jié)構(gòu),而CB的加入可使這些微絲系統(tǒng)得到重構(gòu),形成新的骨架系統(tǒng)以支撐整個細(xì)胞,從而提高豬胚胎的冷凍效率。Vieira A D等[7]報道,OPS玻璃化冷凍牛未成熟(GV)卵母細(xì)胞用CB處理后,其卵裂率和囊胚率與對照冷凍組差異不顯著(49%和3.6%,46.4%和3.6%)。Fujihira T等[16]報道,玻璃化冷凍鯨未成熟卵母細(xì)胞,用CB處理組與未處理組的成熟率差異并不顯著(30.4%和27.3%)。Silvestre M A等[17]報道,在OPS玻璃化冷凍綿羊羔羊GV期卵母細(xì)胞時用CB預(yù)處理,其處理組(8.0%)與未處理組(12.7%)成熟率差異不顯著(P＞0.05)。Somfai T等[18]報道,CB可能會提高SSV玻璃化冷凍豬成熟卵母細(xì)胞后的存活率和發(fā)育率。張波等[19]報道,用5 μ g/mL CB預(yù)處理MⅡ期小鼠卵母細(xì)胞5 min,并沒有提高玻璃化凍融后存活率、受精率和卵裂率。周佰成等[20]用9 μ g/mL CB組處理綿羊GV期卵母細(xì)胞的成熟率顯著高于對照組(19.5%和16.7%)(P＜0.05)。張家新等[21]報道,用濃度7.5 μ g/mL或10.0 μ g/mL CB預(yù)處理綿羊成熟卵母細(xì)胞20 min～25 min可以提高玻璃化冷凍效果。卞桂華等[8]指出,7.5 μ g/mL CB處理MⅡ期水牛卵母細(xì)胞冷凍解凍后,激活后的分裂率差異顯著(55.56%和32.69%,P＜0.05),但存活率和囊胚率與未處理組相比差異均不顯著(88.89%、8.82%和94.20%、14.55%,P＞0.05)。

我們在牛卵母細(xì)胞玻璃化冷凍方面的試驗結(jié)果顯示,在卵裂率方面,20 μ g/mL CB組顯著高于對照組(P＜0.05),且它與 10 μ g/mL CB 組和 30 μ g/mL CB組相比差異顯著(P＜0.05);在囊胚率方面,20 μ g/mL CB組極顯著高于對照組(P≤0.01),同時它還顯著高于其他4個處理組(P＜0.05)。這表明CB在玻璃化冷凍過程中的保護(hù)作用存在一定濃度的依賴性,其中濃度20 μ g/mL CB對牛成熟卵母細(xì)胞玻璃化冷凍效果的改善作用最明顯。

從本試驗可以看出,即使 CB濃度提高到30 μ g/mL,對牛成熟卵母細(xì)胞冷凍后的存活率也沒有明顯的毒副作用。從數(shù)據(jù)分析來看,對冷凍的改善作用并沒有隨CB濃度遞增而一直遞增下去,而是到達(dá)一定濃度后就不再遞增,呈現(xiàn)出下降趨勢,其中的原因還有待進(jìn)一步探索。

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Effects of Cytochalasin B on Vitrification of Bovine Mature Oocytes

GUO Juan1,2,W ANG Zhi-qin2,ZHAO Yun-cheng1,LIN Jia-peng1,HUANG Jun-cheng1

(1.The Key Labof Animal Biotechnology of Ministry of Agriculture,Xinjiang Academy of Animal Sciences,Urumqi,Xinjiang,830000,China;2.College of Veterinary Medicine,Xinjiang Agriculture University,Urumqi,Xinjiang,830052,China)

In the present study,effects of concentration of cytochalasin B(CB)on the development of bovine matured oocyte following solid surface vitrification(SSV)were examined.The results demonstrated that:no significant differences were observed in the survival rate among the control and treatment groups;However,after activation of oocytes,vitrified oocytes treated with 20 mg/mL CB resulted in a higher(47.67%and 30.25%,respectively,P＜0.05)cleavage development rate than that of the control,while the blastocyst development rates were significantly higher(9.00%and 1.75%,respectively,P≤0.01)than that of the control and other treatment groups(P＜0.05).In conclusion,the protective effects of CB have a certain concentration dependence in the vitrification process,especially pretreatment with 20 μ g/mL CB was beneficial for the vitrification of mature bovine oocytes.

oocyte;vitrification;bovine;cytochalasin B

S814.8

A

1007-5038(2010)03-0055-05

2009-09-21

新疆高技術(shù)研究與發(fā)展項目(200841122)和基金項目(200821182);國家863項目(2008AA101007)

郭 娟(1982-),女,河南人,碩士,主要從事動物生殖與發(fā)育研究。*通訊作者