轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊土壤微生物狀況和酶活性分析

趙蓬暉，李淑梅，晏 增，馬永濤，孟利宏

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轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊土壤微生物狀況和酶活性分析

趙蓬暉1，李淑梅2，晏 增1，馬永濤1，孟利宏3

（1.河南省林木種質(zhì)資源保護與良種選育重點實驗室，鄭州 450008；2.中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；3.清豐縣林業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，河南 457300）

對轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊林地和鄰近黑楊林地的土壤微生物狀況和酶活性進行了分析。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因林地中轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株間根系周圍土壤3大類微生物（細(xì)菌、放線菌和霉菌）數(shù)量和酶活性無顯著差異，轉(zhuǎn)基因林地與鄰近林地土壤3大類微生物（細(xì)菌、放線菌和霉菌）數(shù)量和酶活性無顯著差異，初步說明轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊對土壤生態(tài)系統(tǒng)尚未造成明顯的影響。

歐洲黑楊；轉(zhuǎn)基因；土壤微生物；土壤酶

自1983年世界上培植出來第1株轉(zhuǎn)基因植物以來，轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)的安全問題，國際上一直就存在爭論。目前有關(guān)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的生物安全研究較多，其中主要涉及對非目標(biāo)昆蟲、農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)影響，以及基因漂移等[1]，近年來也有一些轉(zhuǎn)基因林木方面的相關(guān)報道和研究。轉(zhuǎn)基因林木對土壤生態(tài)環(huán)境的影響是轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)安全評價的一個重要方面，對10年生轉(zhuǎn)基因黑楊林地土壤微生物狀況和酶活性進行了分析。

1 材料和方法

1.1 試驗地概況

試驗地設(shè)在河南省濮陽林業(yè)科學(xué)研究所實驗林場，地處中緯地帶，常年受東南季風(fēng)環(huán)流的控制和影響，四季分明，春季干旱多風(fēng)沙，夏季炎熱雨量大，秋季晴和日照長，冬季干旱少雨雪。年平均氣溫為13℃左右，曾出現(xiàn)過的極端最高氣溫達(dá)43.1℃，極端最低氣溫有-21℃。無霜期一般有200 d。年平均降水量為500~600 mm。

試驗林為轉(zhuǎn)基因歐洲黑楊與其他非轉(zhuǎn)基因品種的對比試驗林，10年生，面積1 hm2，間距3 m×4 m，4株方形小區(qū)，3次重復(fù)，隨機排列。選取林內(nèi)107楊作為對照。鄰近楊樹林地為107楊，10年生。

1.2 取樣方法

試驗林內(nèi)轉(zhuǎn)基因植株和對照（107楊）植株每個小區(qū)各選取1株采集根系周圍土壤樣品；試驗林內(nèi)轉(zhuǎn)基因楊樹每小區(qū)4株樹中間土壤作為林地土壤，每小區(qū)1份；鄰近107楊林地隨機選取3點采集土樣，采樣點設(shè)在四株方形排列的楊樹中間。土樣采集后放入帶有冰袋的保溫盒中帶回實驗室，一部分4℃冷藏用于微生物計數(shù)，一部分?jǐn)偝杀臃庞谑覂?nèi)陰涼通風(fēng)處風(fēng)干、磨碎、過篩，然后密封保存在冰箱中，用于酶活性分析。

1.3 測定方法

土壤微生物區(qū)系的分析采用稀釋平板法[2]。細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基；真菌采用孟加拉紅培養(yǎng)基；放線菌采用改良高氏1號培養(yǎng)基。

脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法；多酚氧化酶和過氧化物酶活性采用鄰苯三酚比色法；蛋白酶活性采用改良茚三酮比色法；堿性磷酸酶采用磷酸苯二鈉法[3~9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因黑楊林地土壤微生物狀況分析

土壤微生物直接參與土壤中碳、氮的循環(huán)，土壤腐殖質(zhì)的形成以及無機元素的轉(zhuǎn)化過程，在土壤的形成和創(chuàng)造肥力的過程中起著極為重要的作用，土壤微生物的種類和數(shù)量是評價土壤肥沃程度的一個重要指標(biāo)。

2.1.1 根系周圍土壤微生物狀況比較

分別對轉(zhuǎn)基因試驗林中轉(zhuǎn)基因植株與對照植株根系周圍的土壤微生物進行分類計數(shù)，并作統(tǒng)計分析（見表1）。

表1 根系周圍土壤微生物總數(shù)比較

從統(tǒng)計結(jié)果看，轉(zhuǎn)基因植株周圍土壤3大類微生物數(shù)量和微生物總量均略大于對照植株。從3大類微生物分布比例看，細(xì)菌占主體，放線菌次之，真菌最少，轉(zhuǎn)基因植株周圍土壤細(xì)菌數(shù)占總量的94%，對照植株占93%，二者相差不大。對所得數(shù)據(jù)進行方差分析，分析結(jié)果見表2。

表2 根系周圍土壤微生物方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因植株與對照植株根系周圍土壤的細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量和微生物總量均無顯著差異。

由此說明栽培轉(zhuǎn)基因植物對土壤中微生物在數(shù)量上有一定的影響，但是由于土壤微生物數(shù)量本身變化很大[2]，所以這種差異并不是顯著差異。這與周曉罡等2005年研究結(jié)果一致。

2.1.2 林地土壤微生物狀況比較

分別對轉(zhuǎn)基因試驗林及鄰近楊樹林地土壤微生物進行分類計數(shù)，并作統(tǒng)計分析（見表3）。

從表3可以算出，轉(zhuǎn)基因林地和鄰近楊樹林地土壤3大類微生物數(shù)量和總量差異不大。從3大類微生物分布情況看，與根系周圍土壤微生物分布規(guī)律一致，分布比例也一致，轉(zhuǎn)基因林地和鄰近林地細(xì)菌在總量中所占比例分別為94%和93%。對所得數(shù)據(jù)進行方差分析，分析結(jié)果見表4。

表3 林地土壤微生物總數(shù)比較

表4 林地土壤微生物總數(shù)方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因林地與鄰近楊樹林地土壤細(xì)菌、放線菌和真菌數(shù)量和微生物總量均無顯著差異。

從表1和表3還可看出，轉(zhuǎn)基因植株根系周圍的土壤3大類微生物數(shù)量和總量均高于轉(zhuǎn)基因林地，而鄰近楊樹林地根系周圍微生物狀況與林地的微生物狀況差異不明顯。這可能與轉(zhuǎn)基因植株根系分泌物有關(guān)。

2.2 土壤酶活性分析

土壤酶是土壤的組成部分。是1種生物催化劑，參與土壤中的各種生物化學(xué)過程。不僅能反映土壤生物活性的高低，而且能體現(xiàn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化的快慢，在一定程度上能反映土壤的土壤結(jié)構(gòu)、植被類型、土壤肥力等狀況。

2.2.1根系周圍土壤酶活性分析

分別對轉(zhuǎn)基因試驗林中轉(zhuǎn)基因植株與對照植株根系周圍的5種土壤酶活性進行測定，并作統(tǒng)計分析（見表5）。

表5 根系周圍土壤酶活性

從統(tǒng)計結(jié)果看，轉(zhuǎn)基因植株根系周圍的堿性磷酸酶、脲酶、過氧化物酶和蛋白酶活性均略高于對照植株，多酚氧化酶活性轉(zhuǎn)基因植株比對照植株略低。

磷酸酶活性能夠表示有機磷轉(zhuǎn)化狀況；脲酶可以加速土壤中潛在養(yǎng)分的有效化；過氧化物酶可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用；蛋白酶能促土壤含氨有機化合物（蛋白質(zhì)）水解成肽，然后釋出氨，供植物吸收利用。土壤多酚氧化酶是以銅、錳為活性中心的氧化還原酶。這幾類酶均是土壤中重要的生物催化劑，在土壤物質(zhì)能量轉(zhuǎn)化過程中起著十分重要的作用。從統(tǒng)計結(jié)果看，轉(zhuǎn)基因植株根系周圍土壤這幾類酶的活性較對照植株偏高，說明轉(zhuǎn)基因黑楊的種植階段并未引起土壤環(huán)境的惡化。這同土壤微生物狀況的分析結(jié)果一致。對所得數(shù)據(jù)進行方差分析，分析結(jié)果見表6。

方差分析結(jié)果表明，所測定的轉(zhuǎn)基因植株與非轉(zhuǎn)基因植株根系周圍5種土壤酶活性均無顯著差異（見表6）。

2.2.2 林地土壤酶活性分析

分別對轉(zhuǎn)基因試驗林和鄰近楊樹林地5種土壤酶活性進行測定，并作統(tǒng)計分析（見表7）。

統(tǒng)計結(jié)果表明，除蛋白酶外，其他幾類酶轉(zhuǎn)基因林地均比鄰近林地偏低。對統(tǒng)計結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表8。

方差分析結(jié)果表明，所測定的轉(zhuǎn)基因林地和鄰近楊樹林地除多酚氧化酶活性差異在a=0.01水平上表現(xiàn)不顯著外，其他均在a=0.05水平上差異不顯著。

3 結(jié)論與討論

研究得出，轉(zhuǎn)基因植株和對照植株的微生物種類和數(shù)量及酶活性均無顯著差異；轉(zhuǎn)基因林地和鄰近楊樹林地的微生物狀況和酶活性也無顯著差異。初步說楊樹轉(zhuǎn)基因植株未對微生物3大類群的數(shù)量和土壤酶活性有顯著影響。但此結(jié)果僅限于1次取樣的研究結(jié)果，轉(zhuǎn)基因植物對生態(tài)環(huán)境影響的安全性監(jiān)測問題，是一個長期而復(fù)雜的過程，需要對轉(zhuǎn)基因植物進行系統(tǒng)而全面的評價，有必要在此基礎(chǔ)上進行長時間和更加深入的研究。

表6 根系周圍土壤酶活性方差分析

表7 林地土壤酶活性

表8 林地土壤酶活性方差分析結(jié)果

注：*為a=0.05水平上的F值**為a=0.01水平上的F值

轉(zhuǎn)基因植株根系周圍的土壤3大類微生物和總量均高于轉(zhuǎn)基因林地，土壤酶活性也表現(xiàn)出同樣的規(guī)律。這可能與轉(zhuǎn)基因植株根系分泌物有關(guān)。有研究表明轉(zhuǎn)基因作物根系分泌物可改變土壤微生物對外來底物的利用。Sacka和Farrand 對轉(zhuǎn)冠瘓堿（opines）基因煙草根分泌物對兩種假單胞菌影響的研究表明，根系分泌物組成的改變影響物種豐富度。Oger等報道：轉(zhuǎn)甘露堿（mannopine）基因煙草根際土壤以甘露堿為底物的細(xì)菌數(shù)量比非轉(zhuǎn)基因煙草高80倍[2]。但由于森林土壤生態(tài)系統(tǒng)組成、結(jié)構(gòu)、功能復(fù)雜，相關(guān)機理還有待于做深入的研究和探討。

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The Affection on Soil Microorganism and Enzyme Activity of Transgenic Populus Nigra

ZHAO Peng-hui1, LI Shu-mei2, YAN Zeng1, MA Yong-tao1, MENG Li-hong3

（1.Key Laboratory of Forest Germplasm Conservation、Breeding of Improved Variety of Henan-Province, Zhengzhou 450008,China；2. Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091,China；3. Extend Center of Forestry Technique of Qingfeng，Henan 457300,China）

It is more than ten years since transgenic Populus nigra has been tested in the field．In order to evaluate the affection of transgenic forest trees on the environment，The soil microorganism and Enzyme activity in the transgenic plantation and non—transgenic plantation was quantitatively assayed for group．According to the analysis, we surveyed three groups of microorganisms(bacterium sum，actinomyces and mould)and Enzyme activity in the soil around the roots of both non—and transgenic trees，and of both non—and transgenic plantations．Analyzing using ANOVA，we have found no significant difference in terms of the microorganism number and Enzyme activity among both the individual trees and the plantations．It indicates that there are still no significant negative effects of transgenic poplar on the soil microorganism system．

Populus nigra; Transgenic; Microorganisms; Soil enzyme

S714.2

A

1003-2630（2010）04-0001-04

2010-12-05

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目，項目編號330004

趙蓬暉（1973-），女，碩士，高級工程師，主要從事林木遺傳育種研究

（責(zé)任編輯：王文彬）