腎間質(zhì)纖維化中結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)與腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的關(guān)系

陳繼貴,邰智慧,劉 坤,蔣金香,曹進(jìn)麗

(1.華北煤炭醫(yī)學(xué)院腎臟病研究所,河北唐山064200;2.華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤科;3.唐山東華腎病醫(yī)院)

腎間質(zhì)纖維化(RIF)幾乎是所有腎臟疾病進(jìn)展到終末期腎衰竭的共同途徑,在人類腎臟疾病的轉(zhuǎn)歸中起主導(dǎo)作用[1]。肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast,MF)是合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的重要細(xì)胞,特異性地表達(dá)α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA),與組織纖維化的發(fā)展密切相關(guān)。研究表明,在RIF的動(dòng)物模型中,腎組織中部分MF是由小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來,這一過程稱為腎小管上皮細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化(EMT)[2],EMT是腎間質(zhì)纖維化的重要發(fā)病機(jī)制之一[3]。結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的致纖維化生長(zhǎng)因子,研究表明CTGF可以誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[4],促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成,導(dǎo)致腎臟纖維化。本實(shí)驗(yàn)旨在研究CTGF與腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及與腎間質(zhì)纖維化的關(guān)系,并為進(jìn)一步深入研究阻斷CTGF表達(dá)或抑制其活性可否成為一種特異且有效的防治纖維化的手段奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 腎活檢標(biāo)本的收集 收集我院2003年1月至2008年1月腎切除標(biāo)本10例,取正常腎臟組織作為對(duì)照,同期腎間質(zhì)纖維化標(biāo)本42例。男23例,女19例;年齡46-73歲,平均年齡59.5歲。所有患者腎活檢標(biāo)本均用光鏡、免疫熒光檢查,以確定其病理組織類型。42例患者包括不同原因和類型的多種疾病:微小病變/輕微樣病變9例,IgA腎病11例,局灶節(jié)段性硬化5例,膜性腎病2例,腎移植術(shù)后慢排1例,紫癜性腎炎3例,狼瘡性腎炎2例,糖尿病腎病9例。

1.2 腎小管間質(zhì)病變程度的判斷 采用雙盲法,根據(jù)Banff分級(jí)[5],光鏡下腎小管萎縮及間質(zhì)纖維化病變程度半定量分為4級(jí)。0級(jí):正常,腎小管無明顯改變,無纖維化組織增生;1級(jí):腎小管上皮細(xì)胞輕度萎縮、變性,呈灶性分布,纖維組織增生呈小灶性、少量分布,病變范圍＜25%;2級(jí):腎小管上皮細(xì)胞中度萎縮、變性,壞死輕,纖維組織中度增生,病變范圍26%-50%;3級(jí):腎小管上皮細(xì)胞萎縮、變性,壞死重,成片分布,纖維組織增生成束狀、多灶或網(wǎng)狀成片,病變范圍＞50%。

1.3 方法 標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定,石蠟包埋,4 μ m連續(xù)切片4張,行HE染色、α-SMA、CTGF免疫組化染色,PBS代替一抗做空白對(duì)照,實(shí)驗(yàn)步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定 由兩位病理醫(yī)師分別獨(dú)立觀察染色陽性的細(xì)胞。高倍鏡下選5個(gè)腎小管間質(zhì)視野(避開腎小球和大血管),觀察染色細(xì)胞的面積,計(jì)算其平均值;腎小管間質(zhì)中無陽性細(xì)胞染色為0分,偶有染色為1分,局灶染色為2分,彌漫染色為3分。每張切片分別在左上、左下、右上、右下、正中選取5個(gè)盡量不含腎小球及大血管的視野,采用CMIAS真彩色醫(yī)學(xué)圖象分析系統(tǒng)對(duì)各組免疫組化結(jié)果進(jìn)行積分光密度(integral optical density,IOD)測(cè)定,以均值表示每個(gè)標(biāo)本的平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用±s表示。兩組間均數(shù)的比較用 t檢驗(yàn),多組間均數(shù)的比較用方差分析。并將CTGF與α-SMA的積分光密度值進(jìn)行相關(guān)性分析。以P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 腎小管間質(zhì)病變程度的判定 42例腎活檢病理按腎小管間質(zhì)病變程度分級(jí)為:1級(jí)21例,2級(jí)18例,3級(jí)3例;對(duì)照組10例均為0級(jí)。

2.2 CTGF的表達(dá) 0級(jí)的腎小管間質(zhì)中,無或僅有非常少量的CTGF表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的胞漿中。隨病變程度的加重,CTGF的表達(dá)明顯增加。在3級(jí)病變中,隨著病變程度加重,CTGF表達(dá)量顯著增加,廣泛分布于從近端小管到髓質(zhì)集合管處的上皮細(xì)胞胞漿中,甚至在某些變性、壞死、萎縮和脫落到管腔的上皮細(xì)胞中也可見到大量的CTGF蛋白質(zhì)顆粒。腎間質(zhì)中一些成纖維樣的細(xì)胞,也表達(dá)CTGF,并且間質(zhì)的病變?cè)街?表達(dá)量越多,范圍越廣。見表1。

2.3 α-SMA的表達(dá) 在0級(jí)間質(zhì)病變的腎組織,僅表達(dá)于血管平滑肌肌層,在腎間質(zhì)偶有表達(dá),隨病變加重表達(dá)增強(qiáng),3級(jí)病變中廣泛分布于間質(zhì)區(qū)域,一些管腔破壞和萎縮的腎小管上皮細(xì)胞胞漿也可見表達(dá),各組間表達(dá)有顯著性差異。

表1 不同腎間質(zhì)病變程度的腎組織中CTGF 和α-SMA的表達(dá)(±s)

表1 不同腎間質(zhì)病變程度的腎組織中CTGF 和α-SMA的表達(dá)(±s)

與0級(jí)比較,*P＜0.05;與1級(jí)比較,#P＜0.05;與2級(jí)比較,△P＜0.05

組別 例數(shù) CTFG α-SMA對(duì)照組(0級(jí)) 10 0.73±0.21 0病變組(1級(jí))21 8.67±1.88* 12.16±3.11*病變組(2級(jí))18 12.14±1.97# 15.05±3.44#病變組(3級(jí))3 14.90±2.32△ 18.89±2.92△

2.4 CTGF與α-SMA蛋白表達(dá)的相關(guān)性 CTGF因子和α-SMA蛋白在TIF進(jìn)程中表達(dá)的IOD值分別為8.21±5.27、11.94±5.61,相關(guān)性分析 r=0.826,P＜0.01,兩者呈正相關(guān)。

3 討論

CTGF是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的致纖維化生長(zhǎng)因子,定位于染色體6 q23.1,是一分子量為36-38 KD的富含半胱氨酸的肝磷脂結(jié)合多肽,由349個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成。CTGF廣泛存在于多種人類組織中,如心臟、大腦、肺、肝臟、胰腺、腎臟等,尤以腎臟含量最高[6]。大量的動(dòng)物及人體實(shí)驗(yàn)研究證實(shí),在一些病理狀態(tài)下,特別是在伴有細(xì)胞增生和ECM合成的腎小球系膜和小管間質(zhì)病變區(qū),CTGF的表達(dá)明顯增加。CTGF在許多疾病的致纖維化作用中介導(dǎo)了TGF-β的許多功能,在各種病因的慢性腎纖維化進(jìn)程中CTGF表達(dá)常與TGF-β伴隨增高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CTGF在對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞、腎小球及間質(zhì)細(xì)胞中有非常微弱的陽性信號(hào),病變組主要分布于腎小管上皮細(xì)胞及增生的腎間質(zhì)細(xì)胞,并且間質(zhì)的病變?cè)街?間質(zhì)中CTGF的表達(dá)量越多,范圍越廣,進(jìn)一步說明CTGF表達(dá)上調(diào)是各種原因和病理類型的腎臟疾病纖維化的共同表現(xiàn)。

腎小管間質(zhì)纖維化的形成過程中,腎小管上皮細(xì)胞呈現(xiàn)漸進(jìn)性變性、萎縮和消失,通過凋亡而消失是其中的一種轉(zhuǎn)歸,近年的研究發(fā)現(xiàn),損傷的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化而形成肌成纖維細(xì)胞是另一種轉(zhuǎn)歸。病理情況下發(fā)生的細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化對(duì)機(jī)體具有修復(fù)損傷或加重病變的雙重細(xì)胞生物學(xué)意義。腎小管上皮細(xì)胞正常情況下表達(dá)上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白-角蛋白(CK),不表達(dá)α-SMA。Ito等[7]在不同腎病患者腎穿標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)在慢性小管間質(zhì)損害區(qū),表達(dá)CTGFmRNA的細(xì)胞數(shù)隨疾病進(jìn)展而增加,且CTGFm-RNA陽性表達(dá)細(xì)胞出現(xiàn)胞漿α-SMA的表達(dá)。在實(shí)驗(yàn)中我們觀察到:對(duì)照組腎小管上皮細(xì)胞、腎小球及間質(zhì)細(xì)胞中均未見α-SMA表達(dá)的陽性信號(hào),病變組α-SMA主要表達(dá)于腎間質(zhì)的細(xì)胞,我們同時(shí)發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)損傷程度與間質(zhì)α-SMA表達(dá)呈明顯正相關(guān),而且在間質(zhì)損傷較重病例中發(fā)現(xiàn)部分腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA,在這些轉(zhuǎn)分化腎小管上皮細(xì)胞周圍間質(zhì)中可見較多α-SMA陽性細(xì)胞,表明表達(dá)α-SMA的腎小管上皮細(xì)胞有可能會(huì)遷入周圍間質(zhì)而成為腎間質(zhì)MF的直接來源。CTGF與α-SMA的表達(dá)范圍和趨勢(shì)也趨于一致,并且損傷的間質(zhì)和萎縮的腎小管強(qiáng)烈的表達(dá)CTGF和α-SMA。說明CTGF極有可能是參與MF形成,參與腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的又一重要的刺激因子。這提示我們應(yīng)用一定藥物或方法特異性地阻滯CTGF的表達(dá)對(duì)于腎纖維化疾病的治療能有積極的作用。在臨床上,我們期待能夠?qū)ふ乙环N有效的藥物,它能抑制CTGF的促生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)分化的作用,為腎間質(zhì)纖維化的防治提供依據(jù)。

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