不同疏水性能冠脈支架表面對溶血性能及蛋白吸附影響

張基昌,李淑梅,宋春莉,趙 雷,劉 佳,劉 斌*

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院,吉林 長春130041)

冠狀動(dòng)脈血管支架的應(yīng)用是介入心臟學(xué)領(lǐng)域里的重要發(fā)展,支架內(nèi)血栓形成是目前影響冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)預(yù)后的重要因素之一[3]。影響支架表面血栓形成的因素包括:支架表面張力及界面自由能、親水性和疏水性、表面電荷等等[9,10]。優(yōu)異的血液相容性需要親水性和疏水性的平衡[10]。目前對于支架表面疏水強(qiáng)度改變對支架內(nèi)血栓形成影響未有研究。由于目前臨床應(yīng)用的冠脈支架基本為316L不銹鋼,故本文通過硅烷修飾316L不銹鋼獲得不同疏水強(qiáng)度的支架表面,探討疏水強(qiáng)度改變對血液相容性及蛋白吸附的影響,為將來冠狀動(dòng)脈支架表面改性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

丙基三乙氧基硅烷、辛基三乙氧基硅烷、γ-(2、3環(huán)氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(KH560,美國Sigma公司生產(chǎn)),枸櫞酸鈉抗凝血(長春市中心血站提供),316L不銹鋼(購自沈陽國明繁華特種鋼公司)、接觸角測量儀為KRü SS DSA10-MK2,分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 不銹鋼表面疏水處理 樣品為2.0 cm×2.0 cm 316L不銹鋼板,用丙酮超聲處理15 min,之后用清水超聲清洗干凈。用15%的HCl溶液煮沸處理10 min,之后分別用蒸餾水、乙醇超聲處理各三次。配制10%的氫氧化鈉溶液,浸泡處理10 min,使鋼片表面羥基化。之后用水、乙醇沖洗,紅外燈烤干。將處理好的鋼片浸入配制好的硅烷溶液,浸泡,之后用水沖洗,放入110℃烘箱烘干老化處理1 h。

1.2.2 接觸角測試 用接觸角測量儀測量角度,所用液滴為5 μ l。

1.2.3 溶血性能實(shí)驗(yàn) 每個(gè)樣品各取5份,用鑷子夾住材料,取蒸餾水洗滌3次,再用生理鹽水洗滌3次。將洗滌好的材料放入廣口瓶中在37度水浴中恒溫30 min,加入0.2 ml稀釋血液,恒溫60 min。陽性對照和陰性對照分別用10 ml蒸餾水和10 ml生理鹽水各加0.2 ml稀釋血,與樣品同樣操作。隨后以1 500 r/min離心5 min,取上清液2 ml放入比色杯中用分光光度計(jì)在545 nm測吸光度。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。溶血率按如下公式計(jì)算:

溶血率=(樣品吸光度-陰性對照吸光度)/(陽性對照吸光度-陰性對照吸光度)×100%

1.2.4 蛋白吸附實(shí)驗(yàn) 配制BCA工作液,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。取5 g白蛋白溶于1 ml去離子水中,恒溫?cái)嚢?0 min,配制成5%的白蛋白溶液。將三種硅烷修飾的不銹鋼板及裸不銹鋼板置于6孔板中,每孔加3 ml 5%的白蛋白溶液,4℃保存48小時(shí)。保存時(shí)間到后,取每孔中的5%的白蛋白溶液配成0.05%濃度。放入96孔板中,每孔加200 μ l BCA工作液。將96孔板置于37℃放置30分鐘。用分光光度計(jì)測562 nm處吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用SPSS10.0軟件包對資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間比較采用t檢驗(yàn),P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 接觸角結(jié)果

不銹鋼表面接觸角值

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,單純不銹鋼表面為親水表面(接觸角＜90°),羥基化后不銹鋼表面接觸角略有增加,但仍為親水。通過硅烷修飾不銹鋼表面,不銹鋼表面接觸角均大于90,表面為疏水性能,說明其疏水強(qiáng)度增加與其羥基化處理無關(guān),與硅烷接枝有關(guān)。同時(shí)不同硅烷的接枝可得到不同疏水性能的支架表面。

2.2 溶血性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 蛋白吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同疏水強(qiáng)度表面吸附白蛋白量

疏水的不銹鋼表面吸附白蛋白能力較親水的裸不銹鋼均明顯減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。隨著疏水強(qiáng)度增加,應(yīng)用硅烷修飾的不銹鋼表面其吸附白蛋白的能力增強(qiáng)。

3 討論

自從1977年Gruentzig完成第一例冠心病介入治療以來,冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架置入術(shù)已成冠心病治療的重要手段。人們在關(guān)注冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)有效性的同時(shí)更重視其安全性,而支架內(nèi)血栓(stent thrombosis,ST)問題仍是學(xué)術(shù)界討論和研究的熱點(diǎn)[1,2]。支架內(nèi)血栓發(fā)生率雖然很低,但由此帶來的后果卻是致命性的。有關(guān)藥物涂層支架的研究發(fā)現(xiàn),發(fā)生ST后死亡率40%-50%,死亡和AMI總的發(fā)生率為50%-70%[3,4]。目前認(rèn)為急性和亞急性血栓主要與支架置入不滿意(如支架偏小或貼壁不良等),過早停用抗血小板藥物等因素相關(guān)[5,6]。其中支架本身特性也是一個(gè)不可忽視的問題血液與冠脈支架接觸后會(huì)引起血液的一系列變化,最快的變化就是血漿蛋白在支架表面吸附[10,11]。隨著支架表面親水及疏水結(jié)構(gòu)的不同,在支架表面產(chǎn)生白蛋白、球蛋白及各種蛋白質(zhì)的競爭性吸附,在此表面上形成了一層成分復(fù)雜的蛋白吸附層。吸附蛋白層形成后,這一蛋白吸附層將介導(dǎo)生物材料表面和生物內(nèi)環(huán)境發(fā)生生物作用。一般地認(rèn)為吸附白蛋白的能力越強(qiáng),形成血栓的可能性就越小;而吸附纖維蛋白原越多,粘附血栓的可能性就越大[7,8]。故支架表面的親水或疏水結(jié)構(gòu)與支架內(nèi)血栓形成存在密切關(guān)系。

目前對于支架表面何種強(qiáng)度疏水性能最佳無報(bào)道。本研究通過利用硅烷修飾目前支架材料316L不銹鋼,獲得支架表面疏水效果,通過改變硅烷鏈長來改變疏水強(qiáng)度。溶血實(shí)驗(yàn)被認(rèn)為是細(xì)胞毒性評價(jià)的一個(gè)實(shí)驗(yàn),材料直接與血液接觸,因此有必要對其溶血性能進(jìn)行評價(jià)。首先溶血試驗(yàn)結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)材料溶血率合格。研究發(fā)現(xiàn)單純不銹鋼表面及羥基化后不銹鋼表面接觸角均為為親水,通過硅烷修飾不銹鋼表面,不銹鋼表面接觸角均大于90°,說明其疏水強(qiáng)度增加與其羥基化處理無關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)疏水的支架表面吸附白蛋白能力較親水的裸不銹鋼均明顯減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。說明疏水支架表面從白蛋白角度評價(jià)較親水支架表面易形成血栓。在接觸角90°-120°范圍,隨著疏水強(qiáng)度增加,支架表面其吸附白蛋白的能力增強(qiáng),形成血栓幾率減少。但同時(shí)應(yīng)該認(rèn)識(shí)到,支架表面蛋白吸附對血栓的影響,要結(jié)合對纖維蛋白原、γ球蛋白的吸附量,今后可在此方向進(jìn)一步研究對白蛋白、纖維蛋白原、γ球蛋白吸附及它們之間比例,更加全面評價(jià)對血栓形成的影響。

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