Cyclopamine對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞增殖凋亡及Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表達(dá)的影響

李潤(rùn)軍,郝曉蕊,湯秀英,張志耀,孫志新,張宏生,佟 明

(1.河北省秦皇島港務(wù)集團(tuán)有限公司港口醫(yī)院泌尿外科,河北秦皇島,066000;2.河北省秦皇島市第一醫(yī)院CCU,河北秦皇島,066000;3.遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科,遼寧錦州,121001)

近年來(lái)我國(guó)前列腺癌(PCa)發(fā)病率的增長(zhǎng)極為迅速,而晚期前列腺癌的治療至今未取得重大進(jìn)展。研究顯示Hedgehog(Hh)信號(hào)通路在晚期前列腺癌中起到重要作用[1-3],Hh信號(hào)通路異常激活時(shí),還會(huì)引起其它多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Cyclopamine是一種甾族生物堿,從百花科類植物中提取,主要通過(guò)對(duì)抗 Hh下游分子Smoothed(Smo),可以使Smo的空間構(gòu)象發(fā)生改變,抑制Smo的活性從而特異性抑制Hh信號(hào)通路。Cyclopamine目前也沒(méi)有它在其他哺乳類動(dòng)物中有毒害作用的證據(jù),提示cyclopamine可能是一類很有前景的抗腫瘤藥物[4]。而最近一些實(shí)驗(yàn)研究顯示體外培養(yǎng)的常見(jiàn)前列腺癌細(xì)胞系無(wú)Hh信號(hào)通路異常激活[5-6],考慮cyclopamine抑制前列腺癌細(xì)胞增殖是通過(guò)非特異性作用于Hh信號(hào)通路或因細(xì)胞毒性效應(yīng)[5],而Zhang X等[7]的實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明cyclopamine對(duì)癌細(xì)胞的作用與抑制Smo活性無(wú)關(guān),故cyclopamine作用于癌細(xì)胞的確切機(jī)制尚不清楚,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)cyclopamine對(duì)人前列腺癌PC-3細(xì)胞體外增殖抑制,誘導(dǎo)其凋亡及對(duì)Bcl-2,Bax,caspase-9蛋白表達(dá)變化的影響,來(lái)初步探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

人前列腺癌PC-3細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。Cyclopamine購(gòu)自美國(guó)Biomol International公司,二甲基亞砜(DMSO),胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Sigma公司,F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司,胎牛血清購(gòu)自德國(guó) Biochrom公司,噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自北京拜爾迪生物技術(shù)公司,Annexin—V凋亡試劑盒購(gòu)自北京寶賽生物技術(shù)公司,兔抗Bcl-2,Bax,caspase-9多克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz生物科技公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng):將PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含有F12培養(yǎng)液90%,胎牛血清10%,青鏈霉素各100 U/ml培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。2～3 d換液1次,3～5 d用2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代1次,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn):將 PC-3細(xì)胞以 5×103/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板中,100 μ L/孔,每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,并設(shè)對(duì)照組,對(duì)照組是不加處理因素,每天更換F12培養(yǎng)基;置于37℃ 、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h;待細(xì)胞貼壁后,加入不同終濃度 cyclopamine 溶液(1、4、8 、12 μ mol/L),分別培養(yǎng)24,48,72,96,120 h;終止培養(yǎng)前4 h每孔加入MTT溶液(5 mg/mL)20 μ L,繼續(xù)培養(yǎng),終止時(shí)吸棄上清液,每孔加入 100 μ L DMSO,微孔板震蕩器上震蕩10 min,酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度值(OD),在不同濃度藥物作用下,細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率(%)=1-(實(shí)驗(yàn)組平均OD值/對(duì)照組OD值)×100%。

1.2.3 透射電鏡下對(duì)凋亡細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察:將PC-3胞懸液5×106個(gè)接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中,濃度為12 μ mol/L的 cyclopamine處理PC-3細(xì)胞72 h后,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌待檢細(xì)胞,再加入3%戊二醛4℃放置10 min,然后離心,接著按照透射電鏡的常規(guī)方法制片:前固定,清洗,后固定,脫水,浸透,包埋,聚合,修塊,制備成超薄切片,透射電鏡下觀察。

1.2.4 流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率:將PC-3細(xì)胞懸液 1×106個(gè)接種于 6孔板中;設(shè)立 cyclopamine為3個(gè)藥物濃度:4,8,12 μ mol/L,及對(duì)照組。對(duì)照組是不加處理因素,每天更換F12培養(yǎng)基,共4組細(xì)胞,置于 37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后將培養(yǎng)液吸棄加藥,作用于細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h;收集貼壁及懸浮細(xì)胞,1 000 r/min,離心 5 min,棄上清液;加入新鮮配制PBS(pH=7.4)3 mL洗2次,1 000 r/min,離心5 min;棄上清液,將細(xì)胞重懸于200 μ L Binding Buffer;加入 10 μ L Annexin V-FITC和5 μ L PI,輕輕混勻,避光室溫反應(yīng) 15 min,加入300 μ L Binding Buffer,1 h內(nèi)在流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 Western印跡技術(shù):將PC-3細(xì)胞分瓶并置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。加藥處理(分組和加藥方法同上),作用于細(xì)胞溫育72 h后,收集細(xì)胞,PBS洗滌細(xì)胞,加細(xì)胞裂解液,超聲破碎細(xì)胞,Lowry法測(cè)定蛋白濃度。SDSPAGE凝膠電泳分離細(xì)胞總蛋白,將蛋白通過(guò)電轉(zhuǎn)移印跡到PVDF膜上,5%牛血清白蛋白/PBS液封閉PVDF膜;蛋白上樣量分別為50 μ g,一抗?jié)舛葹?∶500,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(二抗?jié)舛纫矠?∶500)結(jié)合,ECL試劑發(fā)光,X膠片曝光,顯影,定影,將條帶掃描后灰度分析。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MTT法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

檢測(cè)不同濃度的cyclopamine作用不同時(shí)間對(duì)PC-3細(xì)胞增殖的影響(圖1),結(jié)果顯示1 μ mol/L組對(duì)PC-3細(xì)胞無(wú)明顯增殖抑制作用,與對(duì)照組相比差異無(wú)顯著性(P>0.05)。4 μ mol/L 組 ,8 μ mol/L 組及 12 μ mol/L 組對(duì) PC-3細(xì)胞增殖有顯著抑制作用,抑制效果都隨著濃度增大,時(shí)間的增加而增強(qiáng),與對(duì)照組相比差異有顯著性(P<0.05或 P<0.01),其中 8 μ mol/L組于72 h達(dá)到IC50。

圖1 Cyclopamine作用PC-3細(xì)胞后對(duì)增殖的影響實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比較:＊P<0.05,＊＊P<0.01

2.2 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

12 μ mol/L濃度的cyclopamine溶液處理PC-3細(xì)胞72 h后見(jiàn)細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞變圓,胞膜皺縮,邊緣毛糙,形成不規(guī)則突起,胞漿內(nèi)見(jiàn)凋亡小體及增多的空泡,細(xì)胞核染色質(zhì)發(fā)生邊集,固縮,在細(xì)胞核膜周邊聚集形成新月體形或花瓣形,電子密度增強(qiáng)(圖2)。

圖2 12 μ mol/L濃度的cyclopamine作用72 h后PC-3細(xì)胞發(fā)生凋亡電鏡超微結(jié)構(gòu)圖(×5 000)

2.3 流式細(xì)胞儀分析結(jié)果

使用AV-PI雙染法后經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定了不同 濃 度 cyclopamine(4 μ mol/L,8 μ mol/L,12μ mol/L)作用PC-3細(xì)胞72 h后細(xì)胞的凋亡率分別為(8.19±1.58)%、(29.50±3.21)%、(40.78±4.67)%,對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率(3.27±0.35)%,結(jié)果說(shuō)明cyclopamine對(duì)PC-3細(xì)胞有誘導(dǎo)其凋亡作用,各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且細(xì)胞凋亡率隨著cyclopamine濃度增大而增加(圖3)。

2.4 Western印跡技術(shù)檢測(cè)結(jié)果

不同濃度 cyclopamine(4 μ mol/L,8 μ mol/L,12 μ mol/L)處理細(xì)胞72 h后,隨著藥物濃度逐漸增加,Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少,而B(niǎo)ax,激活的casapse-9(Cleaved casapse-9)蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng),而內(nèi)參β-actin蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(圖4)。

3 討 論

圖3 不同濃度cyclopamine作用PC-3細(xì)胞72 h后細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖

圖4 不同濃度cyclopamine作用PC-3細(xì)胞72 h后Bcl-2,Bax及caspase-9蛋白表達(dá)變化

Hedgehog信號(hào)通路,在早期胚胎多器官系統(tǒng)的正常發(fā)育過(guò)程中起到關(guān)鍵作用,而持續(xù)的Hh通路刺激可誘發(fā)20%～25%人類腫瘤。在哺乳動(dòng)物中有3種Hh同源物,分別是Sonic Hedgehog(Shh)、Indian Hedgehog(Ihh)、Desert Hedgehog(Dhh)。Hh信號(hào)的接收和傳導(dǎo)由位于靶細(xì)胞膜上的Patched(Ptch)和 Smoothened(Smo)組成的復(fù)合物控制。Ptch是Hh的受體,在正常情況下,Ptch與Smo組成復(fù)合物,抑制了Smo的信號(hào)活性,從而抑制下游通路。當(dāng)Ptc和Hh結(jié)合以后,解除Ptch對(duì)Smo的抑制作用,從而使Smo活化,促使下游通路轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白與蛋白激酶A(PKA)及一些未知因子與微管形成大分子復(fù)合物,使得全長(zhǎng)Gli蛋白進(jìn)入核內(nèi)激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄[8]。Hh信號(hào)通路與很多已知調(diào)控細(xì)胞分化增殖的Notch,Wnt,Ras-Erk,生長(zhǎng)因子等信號(hào)通路之間有交叉作用。一些研究顯示,Hh信號(hào)通路與前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1-3]。而cyclopamine作為Hh信號(hào)通路特異性抑制劑作用于該通路中的Smo,特異性抑制Hh信號(hào)通路,抑制了體外培養(yǎng)的人類前列腺癌細(xì)胞的增殖[1-3]和異種移植于鼠體的前列腺癌的生長(zhǎng)[1,9],從而治療前列腺癌取得了顯著的效果。最近一些實(shí)驗(yàn)研究顯示體外培養(yǎng)的常見(jiàn)前列腺癌細(xì)胞系無(wú)Hh信號(hào)通路異常激活[5-6],故cyclopamine作用于癌細(xì)胞可能有其他的機(jī)制,而確切機(jī)制仍尚不清楚。有研究表明,cyclopamine作用于PC-3細(xì)胞增加P-27蛋白表達(dá)水平,抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子-II(IGF-II)的表達(dá)和Akt的激活[10]。Cyclopamine誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡可下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá),激活casapse-9的表達(dá)[11]。本研究是cyclopamine誘導(dǎo)人前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡在線粒體途徑引起B(yǎng)cl-2,Bax及caspase-9蛋白表達(dá)的變化對(duì)其機(jī)制做初步探討。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),cyclopamine有抑制PC-3細(xì)胞增殖的作用。1 μ mol/L濃度組對(duì)PC-3細(xì)胞無(wú)明顯增殖抑制作用,4 μ mol/L組,8 μ mol/L及12 μ mol/L組對(duì)PC-3細(xì)胞增殖有顯著抑制作用,三者抑制效果都隨著時(shí)間的增加而增強(qiáng),表明在一定劑量和時(shí)間范圍內(nèi)呈時(shí)間-濃度依賴關(guān)系。而透射電鏡下可觀察到PC-3細(xì)胞凋亡后超微結(jié)構(gòu)變化,呈典型的凋亡樣改變。作者使用AV-PI雙染法后經(jīng)流式細(xì)胞儀測(cè)定了 4 μ mol/L組,8 μ mol/L及12 μ mol/L組作用 PC-3細(xì)胞 72 h后細(xì)胞的凋亡率,結(jié)果說(shuō)明cyclopamine對(duì)PC-3細(xì)胞有誘導(dǎo)其凋亡作用,且細(xì)胞凋亡率隨著 cyclopamine濃度增大而增加,表明呈濃度依賴關(guān)系。

細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程,主要包括兩大執(zhí)行途徑,即線粒體途徑和死亡受體途徑。線粒體途徑它可使細(xì)胞色素C從線粒體中釋放至胞漿中,從而激活caspase-9,一旦caspase-9被激活,即激活下游的效應(yīng)caspase,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族是線粒體途徑凋亡過(guò)程中主要的調(diào)控因子,該家族成員可以調(diào)節(jié)細(xì)胞色素的釋放同時(shí)也可直接或間接激活caspase。Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白(anti-apoptotic proteins),如Bcl-2,Bcl-Xl,Mcl-1,Bfl-1,Bcl-W,Bcl-G等,促凋亡蛋白(pro-apoptotic proteins),如Bax,Bak,Bok,Bad,Bid,Bik,Bim等[12]?？沟蛲龅鞍譈cl-2與促凋亡蛋白Bax間的比例在維持體內(nèi)平衡中起重要作用,Bcl-2蛋白表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)可使細(xì)胞免遭凋亡。反之,Bax蛋白表達(dá)占優(yōu)勢(shì)時(shí)則促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本研究顯示cyclopamine作用于PC-3細(xì)胞72 h后,Bcl-2蛋白表達(dá)逐漸減少,同時(shí)Bax蛋白表達(dá)逐漸增強(qiáng),因此使Bax/Bcl-2比值顯著增高,有利于促進(jìn)細(xì)胞凋亡。相應(yīng)的,隨著藥物濃度逐漸增加,激活的casapse-9(Cleaved casapse-9)蛋白表達(dá)也逐漸增強(qiáng)。本研究證實(shí)了cyclopamine有抑制PC-3細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)其凋亡作用,并通過(guò)線粒體途徑下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和上調(diào)促凋亡蛋白Bax表達(dá),激活casapse-9的表達(dá),從而激活下游的效應(yīng)caspase,促使細(xì)胞凋亡,這可能是其作用機(jī)制之一。而cyclopamine是細(xì)胞毒效應(yīng)還是作用于其他信號(hào)通路而誘發(fā)細(xì)胞在線粒體途徑凋亡引起B(yǎng)cl-2,Bax,casapse-9蛋白表達(dá)改變尚不明確,cyclopamine誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制等還有待于進(jìn)一步研究。

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