端粒酶hTERT亞單位啟動(dòng)子靶向性慢病毒對(duì)腫瘤活體實(shí)時(shí)顯像的實(shí)驗(yàn)研究

余松濤,楊應(yīng)斌,史春夢(mèng),陳 陵,湯旭東,黎 川,師紅磊,李長珠,李 寧,王國珍,吳玉云,房殿春,楊仕明

(1.重慶第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院全軍消化病研究所,400038;2.重慶西南大學(xué)生命科學(xué)院,400715;3.重慶第三軍醫(yī)大學(xué)預(yù)防醫(yī)學(xué)院全軍復(fù)合傷研究所,400038)

腫瘤轉(zhuǎn)移早期診斷是臨床選擇治療方式的重要依據(jù)。雖然CT、MRI和超聲技術(shù)的發(fā)展對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的診斷提供了重要手段,但它們共同的缺點(diǎn)是不能區(qū)分影像學(xué)所見的良惡性,亦不能有效地早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶。正電子發(fā)射CT(PETCT)是目前唯一能區(qū)分組織良惡性的影像學(xué)診斷方式,對(duì)轉(zhuǎn)移瘤的診斷明顯好于CT、MRI,但PET-CT對(duì)炎性增生還是惡性增殖病灶有時(shí)難以鑒別,而且CT、MRI和PET檢測費(fèi)用昂貴。分子影像診斷一直是腫瘤轉(zhuǎn)移早期診斷的研究熱點(diǎn),但最主要的問題在定性方面缺乏腫瘤的靶向性。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人們逐漸認(rèn)識(shí)到腫瘤特異性的的標(biāo)志物在腫瘤的分子影像診斷中可以發(fā)揮重要作用。但目前發(fā)現(xiàn)的一些腫瘤標(biāo)志物,如CEA、AFP、PSA由于特異性太高,只能作為特殊腫瘤的診斷方案而無法診斷一般腫瘤。因此有必要尋找一種腫瘤共有的標(biāo)志物用于腫瘤的分子顯像。文獻(xiàn)及作者的研究表明,端粒酶及其催化亞單位(hTERT)在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),而在體細(xì)胞中少有表達(dá),針對(duì)hTERT的腫瘤免疫治療只殺傷腫瘤細(xì)胞,而對(duì)正常體細(xì)胞無明顯殺傷效應(yīng),提示hTERT具有良好的腫瘤靶向性[1-6]。hTERT啟動(dòng)子作為限速酶的調(diào)控元件,理論上具有對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向調(diào)控能力[7]。本研究根據(jù)將文獻(xiàn)報(bào)道[8]的優(yōu)化型的hTERT啟動(dòng)子克隆至一種啟動(dòng)子功能檢測質(zhì)粒pGL3-basic中,檢測優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子的活性,以SV40,CMV啟動(dòng)子為陽性對(duì)照,野生型hTERT啟動(dòng)子為野生對(duì)照,空白無啟動(dòng)子的pGL3-basic為陰性對(duì)照。隨后構(gòu)建了含有優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子或?qū)φ誄MV啟動(dòng)子的慢病毒表達(dá)質(zhì)粒pLentihTERTp-GFP和pLenti-CMVp-GFP,并采用第3代慢病毒包裝系統(tǒng)將其重組為慢病毒顆粒。然后采用小動(dòng)物熒光成像系統(tǒng)從體內(nèi)及體外2個(gè)方面研究優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子在腫瘤靶向性診斷中的作用,為臨床腫瘤靶向性分子診斷提供新的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

啟動(dòng)子功能檢測實(shí)驗(yàn):啟動(dòng)子功能檢測質(zhì)粒pGL3-Basic獲贈(zèng)于第三軍醫(yī)大學(xué)遺傳學(xué)教研室黃剛博士后。質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體DOTAP購于德國羅氏公司(Roche)。熒光素酶檢測試劑盒購于Promega公司。熒光素酶檢測設(shè)備采用Luminoskan Ascent(芬蘭,Thermo Labsystems公司)。

慢病毒構(gòu)建:慢病毒載體質(zhì)粒pLenti6/V5-DTOPO購于invitrogen公司。慢病毒包裝質(zhì)粒pMDLg/pRRE,pRSV-Rev和pMD 2.G均獲贈(zèng)于上海比昂生物技術(shù)有限公司。啟動(dòng)子序列人工合成、所有引物合成、質(zhì)粒測序均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。細(xì)胞內(nèi)GFP觀察采用第三軍醫(yī)大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室德國Leica TCS SP5型激光共聚焦顯微鏡。小動(dòng)物活體成像采用第三軍醫(yī)大學(xué)復(fù)合傷研究所的KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System FX(美國)系統(tǒng)。

細(xì)胞株:293FT人胚腎細(xì)胞、HepG2人肝癌細(xì)胞、SGC-7901人胃癌細(xì)胞、SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞、A375人惡性黑素瘤細(xì)胞、U2OS和 SaoS-2人骨肉瘤細(xì)胞均購于上海中科院細(xì)胞所,原代培養(yǎng)的人胚胎成纖維細(xì)胞HF獲贈(zèng)于第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院燒傷研究所梁光萍博士?；蚪MDNA純化試劑盒購于QIAGEN公司。細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI 164、DMEM、小牛血清和胎牛血清購于Hy-Clone公司。hTERT一抗購于 Santa Cruz(美國),GFP一抗購于中杉金橋(中國北京)。

1.2 各株細(xì)胞內(nèi)端粒酶催化亞單位的表達(dá)檢測

采用免疫組化和 western blot方法檢測hTERT在各株細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。方法見文獻(xiàn)[3]和[9]。

1.3 啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì),人工合成及功能檢測

1.3.1 啟動(dòng)子序列設(shè)計(jì),人工合成:根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道全基因合成優(yōu)化型的hTERT啟動(dòng)子,該啟動(dòng)子保留了野生型hTERT啟動(dòng)子的核心序列,并在其中插入3個(gè)Myc家族調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)E-box(CACGTG)[8],以增強(qiáng)啟動(dòng)子在腫瘤細(xì)胞內(nèi)被Myc上調(diào)其功能的潛力。優(yōu)化后啟動(dòng)子長度為295 bp,被全基因合成至pUC57質(zhì)粒上,同時(shí)在兩端合成酶切位點(diǎn)ClaⅠ和BamH Ⅰ以便插入慢病毒載體質(zhì)粒。

1.3.2 啟動(dòng)子功能檢測質(zhì)粒pGL3-hTERTp,pGL3-CMVp的構(gòu)建:pGL-hTERTp質(zhì)粒構(gòu)建:設(shè)計(jì)引物上游 3′cttgagctcccgatacgcatcgatcacag5′,下游 3′gccagatcttacctcgcgaatgcatctag5′,從 pUC57質(zhì)粒上PCR擴(kuò)增hTERT啟動(dòng)子片段,上下游引物分別含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)BglⅡ和SacⅠ,以便酶切后插入pGL-Basic質(zhì)粒中的啟動(dòng)子位置。然后將pGL-Basic用BglⅡ和SacⅠ雙酶切后獲得線性片段。再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物hTERT啟動(dòng)子片段鏈接進(jìn)入線性片段,獲得pGL-hTERTp質(zhì)粒。

pGL-CMVp質(zhì)粒構(gòu)建:設(shè)計(jì)引物上游 3′cgactcgagagttccgcgttacataactt-5′,下游 3′gctaagctt tcggtgtcttctatggaggt-5′,從 pLenti6/V5-D-TOPO質(zhì)粒上PCR擴(kuò)增CMV啟動(dòng)子片段,上下游引物分別含有相應(yīng)酶切位點(diǎn)XhoⅠ和HindⅢ,以便酶切后插入pGL-Basic質(zhì)粒中的啟動(dòng)子位置。然后將pGL-Basic用XhoⅠ和HindⅢ雙酶切后獲得線性片段。再將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物CMV啟動(dòng)子片段鏈接進(jìn)入線性片段,獲得pGL-CMVp質(zhì)粒。

1.3.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和熒光素酶檢測:用DOTAP法將 pGL3-hTERTp、pGL3-CMVp、pGL3-SV40p(Promega公司附贈(zèng)的陽性對(duì)照質(zhì)粒)、pGL3-Basic(含空白啟動(dòng)子位置,作為陰性對(duì)照)、pGL3-hTERTp(original)(含野生型hTERT啟動(dòng)子,作為野生對(duì)照,西南醫(yī)院燒傷所梁光萍博士贈(zèng)送)五株質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染以上8株細(xì)胞。轉(zhuǎn)染72 h候提取蛋白,按照Promega公司提供的的操作程序做標(biāo)準(zhǔn)的熒光素酶檢測。

1.4 慢病毒構(gòu)建和最優(yōu)感染倍數(shù)的測定

1.4.1 慢病毒載體質(zhì)粒pLenti-hTERTp-GFP,pLenti-CMVp-GFP的構(gòu)建:本實(shí)驗(yàn)采用第3代慢病毒真核表達(dá)載體質(zhì)粒pLenti6/V5 TOPO作為慢病毒載體骨架質(zhì)粒。用Bam H 1和Cla 1(BspD 1的同工酶)將pLenti6/V5 TOPO內(nèi)的CMV啟動(dòng)子切掉,將pUC57中的 hTERT啟動(dòng)子也用Bam H 1和Cla 1切下并連接入線性pLenti6/V5 TOPO內(nèi),命名為 pLenti-hTERTp-GFP。將pLenti6/V5 TOPO本身改名為pLenti-CMVp-GFP,作為啟動(dòng)子功能對(duì)照的慢病毒質(zhì)粒。作者采用四質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng),將三個(gè)包裝質(zhì)粒pMDLg/pRRE,pRSV-Rev和pMD2.G用DOTAP共轉(zhuǎn)染法與載體質(zhì)粒pLenti-hTERTp-GFP或pLenti-CMVp-GFP共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染72 h后收集病毒上清,0.22 μ m針式濾器過濾,并采用超速離心法濃縮病毒100倍。

1.4.2 慢病毒滴度檢測:本實(shí)驗(yàn)采用 RT-PCR法測定載體中特征WPRE序列以檢測病毒滴度。24孔平板培養(yǎng)Hela細(xì)胞,每孔細(xì)胞量5×104,將系列稀釋后的病毒顆粒分別加入24-well培養(yǎng)板,72 h后,用基因組DNA純化試劑盒(QIAGEN)提取病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的Hela細(xì)胞基因組。real time PCR的WPRE序列引物為上游(1277F):ccgtttcaggcaacgtg;下游(1361R):agctgacaggtggt ggcaat;探針(1314P):FAM-tgctgacgcaacccccact ggt-TAMRA。β-actin序列引物上游:gcgagaagatgacccagctc;下游:ccagtggtacggccagagg;探針:FAM-ccagccatgtacgttgctatccaggc-TAMRA。實(shí)時(shí)定量PCR采用通用型一步法試劑universal PCR master mix(Promega)。

1.4.3 慢病毒最佳感染倍數(shù)的確定:為了確定慢病毒對(duì)細(xì)胞的最佳感染倍數(shù)(multiplicity of infection,MOI)和感染時(shí)間 ,將2株病毒分別以1 MOI和2 MOI的倍數(shù)感染96孔板內(nèi)的293FT細(xì)胞 。分別在感染后 2、12、24、48、72 h 觀察其GFP表達(dá)情況。以研究其最適合的感染倍數(shù)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間。

1.5 慢病毒體外感染端粒酶陽性及端粒酶陰性細(xì)胞株,以研究其對(duì)端粒酶陽性細(xì)胞的特異性顯像

將慢病毒 Lenti-hTERTp-GFP和 Lenti-CMVp-GFP以2 MOI的感染倍數(shù)感染293 FT,HepG2,SGC-7901,SW480,A375U2OS,SaoS2,HF。在感染后72 h和40 d時(shí)分別用激光共聚焦顯微鏡對(duì)細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)進(jìn)行觀察和拍照。以觀察慢病毒Lenti-hTERTp-GFP在端粒酶陽性細(xì)胞內(nèi)是否能夠特異性長時(shí)表達(dá)GFP。

1.6 慢病毒感染荷瘤裸鼠,以研究其對(duì)端粒酶陽性腫瘤的特異性、實(shí)時(shí)無創(chuàng)的顯像

在本實(shí)驗(yàn)中,首先構(gòu)建了荷瘤裸鼠模型。將15只3周齡的BALB/c裸鼠分為5組,每組3只。在每組裸鼠的雙側(cè)臀部皮下種植腫瘤細(xì)胞。5組分別種 植 HepG2、SGC-7901、SW480、U2OS、SaoS2腫瘤細(xì)胞。各組腫瘤細(xì)胞種植量均為1×106個(gè)/部位。10 d后,將慢病毒 Lenti-hTERTp-GFP以8×106TU/部位瘤內(nèi)注射至所有裸鼠的左側(cè)腫瘤內(nèi)。將慢病毒Lenti-CMVp-GFP以8×106T U/部位瘤內(nèi)注射至所有裸鼠的右側(cè)腫瘤內(nèi)。病毒注射后第24小時(shí)和第30天分別在小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)(KODAK In-Vivo Multispectral Imaging System FX,美國)下觀察腫瘤內(nèi)GFP的表達(dá)。以確定慢病毒Lenti-hTERTp-GFP對(duì)端粒酶陽性腫瘤的特異性活體成像功能。同時(shí)觀察其報(bào)告基因在活體狀態(tài)下的表達(dá)時(shí)間。

病毒注射30 d后,處死裸鼠并剝離腫瘤,做HE切片染色。免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測每塊腫瘤切片內(nèi)GFP蛋白的表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1 各株細(xì)胞內(nèi)端粒酶催化亞單位的表達(dá)檢測

免疫組化實(shí)驗(yàn)和western blot實(shí)驗(yàn)檢測各株細(xì)胞內(nèi)hTERT的表達(dá),發(fā)現(xiàn)293FT、HepG2、SGC-7901、SW480、A375 5株細(xì)胞為 hTERT 陽性,而U2OS、SaoS2、HF 3株細(xì)胞為 hTERT 陰性(圖1)。

圖1 免疫組化和Western blot檢測hTERT在8株細(xì)胞中的表達(dá) ×200

2.2 啟動(dòng)子功能檢測質(zhì)粒pGL3-hTERTp,pGL3-CMVp的構(gòu)建

用相應(yīng)的內(nèi)切酶對(duì) pGL-hTERTp和 pGLCMVp質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測序鑒定。其電泳結(jié)果(圖2)和測序結(jié)果(圖略)均證實(shí)各片段正確插入。

圖2 pGL-hTERTp和pGL-CMVp質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 熒光素酶檢測結(jié)果

Luciferase檢測結(jié)果:我們對(duì)八株細(xì)胞轉(zhuǎn)染各質(zhì)粒后測得的熒光素酶強(qiáng)度做直方圖分析(圖3)。發(fā)現(xiàn)在3株端粒酶陰性的細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染了pGL-hTERTp和pGL-hTERTp(original)質(zhì)粒的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了陰性對(duì)照質(zhì)粒pGL-Basic的細(xì)胞具有相同的熒光素酶強(qiáng)度,均趨近于零。而轉(zhuǎn)染了陽性對(duì)照質(zhì)粒pGL-CMVp和pGL-SV40p的細(xì)胞均具有很強(qiáng)的熒光素酶強(qiáng)度,介于 50-100(圖3A)。在五株端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞株內(nèi),轉(zhuǎn)染了pGL-hTERTp和pGL-hTERTp(original)質(zhì)粒的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了陽性對(duì)照質(zhì)粒pGL-CMVp和pGLSV40p的細(xì)胞具有相同的熒光素酶強(qiáng)度,均位于50～120;同時(shí) pGL-hTERTp組較之 pGL-hTERTp(original)組的熒光素酶強(qiáng)度稍高(圖3B)。該結(jié)果證實(shí)了采用的優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子能夠在端粒酶陽性細(xì)胞中特異性啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)。可以用于腫瘤體特性活體光學(xué)成像。

圖3 雙熒光素酶試驗(yàn)檢測優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子的功能

2.4 慢病毒構(gòu)建、滴度檢測和最優(yōu)感染倍數(shù)的選定

用相應(yīng)的內(nèi)切酶分別酶切鑒定pLentihTERTp-GFP和pLenti-CMVp-GFP質(zhì)粒,證實(shí)了hTERT或CMV啟動(dòng)子和GFP的正確長度(圖4)。并同時(shí)進(jìn)行了測序鑒定(圖略)。

將PCR測得的WPRE序列拷貝數(shù)代入公式Tu/mL=(wpre/β-actin)×細(xì)胞數(shù) ×1 000 μ L/mL×稀釋倍數(shù),計(jì)算得出 Lenti-hTERTp-GFP滴度為2.75×108T U/mL,Lenti-CMVp-GFP滴度為3.6×108TU/mL。在 1MOI和2MOI病毒感染后的 293FT 細(xì)胞中,感染后 2、12、24 、48 、72 h 的EGFP表達(dá)情況被激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照(圖5),證實(shí)2MOI的為最佳感染倍數(shù)。

圖4 酶切鑒定pLenti-hTERTp-GFP和pLenti-CMVp-GFP質(zhì)粒

圖5 病毒最佳感染倍數(shù)(MOI)測定 ×100

2.5 慢病毒體外感染細(xì)胞后,對(duì)端粒酶陽性細(xì)胞的特異性顯像

在病毒感染后72 h,觀察發(fā)現(xiàn) LentihTERTp-GFP感染的端粒酶陽性細(xì)胞內(nèi)均有GFP表達(dá),而端粒酶陰性細(xì)胞內(nèi)無GFP表達(dá);對(duì)照慢病毒Lenti-CMVp-GFP感染的端粒酶陽性和陰性細(xì)胞內(nèi)均有GFP表達(dá)。證實(shí)了含有hTERT啟動(dòng)子的慢病毒Lenti-hTERTp-GFP具有在端粒酶陽性細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)報(bào)告基因的能力。在感染后第40天拍照發(fā)現(xiàn),Lenti-hTERTp-GFP感染后的端粒酶陰性細(xì)胞內(nèi)仍然無GFP表達(dá),而端粒酶陽性細(xì)胞的GFP表達(dá)豐度無衰減(圖6)。進(jìn)一步證實(shí)了該慢病毒的端粒酶特異性,同時(shí)證實(shí)該慢病毒具有較高的目的基因整合效率,從而達(dá)到長時(shí)表達(dá)報(bào)告基因GFP。

2.6 慢病毒感染荷瘤裸鼠后,對(duì)端粒酶陽性腫瘤的特異性、實(shí)時(shí)無創(chuàng)顯像

在病毒注射后第 24小時(shí),Lenti-hTERTp-GFP感染后的端粒酶陽性腫瘤均能在活體成像系統(tǒng)下被觀察到,而感染了Lenti-hTERTp-GFP的端粒酶陰性腫瘤不能被觀察到。同時(shí),對(duì)照病毒Lenti-CMVp-GFP感染后的所有端粒酶陽性和陰性的腫瘤均能被觀察到(圖7 A)。說明慢病毒Lenti-hTERTp-GFP能夠在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異表達(dá)GFP并在活體成像系統(tǒng)下實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤進(jìn)行特異性的整體水平無創(chuàng)觀察。第30天的活體成像觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)各個(gè)腫瘤范圍均有明顯擴(kuò)大,而Lenti-hTERTp-GFP感染后的腫瘤仍然只有端粒酶陽性腫瘤有GFP表達(dá),且表達(dá)強(qiáng)度和范圍均有大幅增加。而端粒酶陰性腫瘤內(nèi)仍然沒有GFP表達(dá)(圖7 B)。說明 Lenti-hTERTp-GFP能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)端粒酶陽性腫瘤進(jìn)行長時(shí)的活體成像。剝離腫瘤的HE染色證實(shí)其腫瘤細(xì)胞的特殊形態(tài)(圖 8A)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)感染了 LentihTERTp-GFP的端粒酶陰性腫瘤內(nèi)無GFP蛋白的表達(dá),其余腫瘤均有GFP蛋白的表達(dá)(圖8B)。進(jìn)一步證實(shí)了Lenti-hTERTp-GFP慢病毒具有端粒酶特異性。

圖6 慢病毒體外感染八株細(xì)胞后對(duì)端粒酶陽性細(xì)胞的特異性顯像(200倍)

圖7 慢病毒活體感染荷瘤裸鼠后對(duì)端粒酶陽性腫瘤的特異性顯像。左側(cè)為活體熒光圖像,右側(cè)為同一體位下的白光圖像,所有裸鼠左側(cè)腫瘤均注射Lenti-hTERTp-GFP、右側(cè)腫瘤均注射Lenti-CMVp-GFP。

圖8 慢病毒感染活體腫瘤后GFP蛋白的表達(dá)

3 討 論

活體生物體內(nèi)光學(xué)成像(optical in vivo imaging)主要采用生物發(fā)光(bioluminescence)與熒光(fluorescence)2種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA,而熒光技術(shù)則采用熒光報(bào)告基團(tuán)(GFP、RFP)進(jìn)行標(biāo)記,利用報(bào)告基因產(chǎn)生的生物發(fā)光、熒光蛋白質(zhì)或染料產(chǎn)生的熒光就可以形成體內(nèi)的生物光源。兩者的主要區(qū)別在于前者是動(dòng)物體內(nèi)的自發(fā)熒光,不需要激發(fā)光源;而后者則需要外界激發(fā)光源的激發(fā)。雖然哺乳動(dòng)物組織是不透光的,但是利用靈敏的光子成像技術(shù)可以從動(dòng)物體表檢測到組織內(nèi)部的生物光源?；铙w生物光學(xué)成像由敏感的熒光照相機(jī)(charge coupled device camera,CCD camera)及其分析軟件和作為報(bào)告子的熒光素酶/熒光素或熒光蛋白組成。報(bào)告基因可以被插入多種基因的啟動(dòng)子之后,通過監(jiān)測報(bào)告基因的表達(dá)情況,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶細(xì)胞或靶分子表達(dá)的實(shí)時(shí)監(jiān)測[10-11]。

活體生物體內(nèi)光學(xué)成像技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)[10-11]:①無創(chuàng)性:與傳統(tǒng)的將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處死后再進(jìn)行組織染色、酶活性分析的方法相比具有巨大的優(yōu)勢(shì);②可以在不同時(shí)相點(diǎn)多次重復(fù):這樣可在同一動(dòng)物體內(nèi)獲得全部時(shí)相點(diǎn)的全部數(shù)據(jù),既節(jié)省了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,又節(jié)省了時(shí)間以及實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi),更重要的是避免了不同實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間的個(gè)體差異以及傳統(tǒng)檢測方法誤差所造成的對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響;③快速實(shí)時(shí)掃描成像;④可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物整體活體成像;⑤敏感性高:有學(xué)者報(bào)告活體生物光學(xué)成像技術(shù)檢測腫瘤細(xì)胞的敏感性甚至超過了流式細(xì)胞儀體外檢測的敏感性[12];⑥毒副作用小:與其他用于檢測細(xì)胞游走增殖的標(biāo)記技術(shù)如熒光染料、放射性探針等相比,活體生物光學(xué)成像技術(shù)對(duì)靶細(xì)胞無毒副作用,并且也不會(huì)因?yàn)榘屑?xì)胞增殖分裂,信號(hào)稀釋而喪失標(biāo)記作用。

借助活體生物光學(xué)成像技術(shù)實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤的發(fā)生發(fā)展的病理生理過程是當(dāng)前西方發(fā)達(dá)國家一個(gè)非常重要、發(fā)展非常迅速的前沿研究領(lǐng)域。它可以直接快速地觀察各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移,并可對(duì)癌癥治療中癌細(xì)胞的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測和評(píng)估[13]?；铙w生物發(fā)光成像能夠無創(chuàng)傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉(zhuǎn)移瘤及自發(fā)瘤[14-16]。目前的生物成像技術(shù)提高了檢測的靈敏度,即使微小的轉(zhuǎn)移灶也能被檢測到(可以檢測到體內(nèi)100個(gè)細(xì)胞的微轉(zhuǎn)移)[12]。

基于以上分析,作者利用文獻(xiàn)報(bào)道的合成優(yōu)化的hTERT啟動(dòng)子序列[8],將優(yōu)化后的hTERT啟動(dòng)子全基因克隆到一種啟動(dòng)子功能檢測質(zhì)粒pGL3-basic中,以熒光素酶作為報(bào)告基因,對(duì)啟動(dòng)子的功能進(jìn)行量化檢測并分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子只在端粒酶陽性的腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)熒光素酶,而在所有端粒酶陰性的細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)熒光素酶。同時(shí),陽性對(duì)照啟動(dòng)子SV40,CMV啟動(dòng)子在所有細(xì)胞內(nèi)均能表達(dá)熒光素酶,而陰性對(duì)照組(無啟動(dòng)子的pGL3-basic質(zhì)粒)在所有細(xì)胞內(nèi)均不能表達(dá)熒光素酶。說明優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子具有嚴(yán)格的端粒酶特異行。而且,結(jié)果顯示在端粒酶陽性細(xì)胞內(nèi),優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子的功能還略高于野生型hTERT啟動(dòng)子的功能,顯示優(yōu)化后的啟動(dòng)子不僅片段長度大大減小,降低了被其他因素調(diào)控的概率,而且由于添加了E-box而增強(qiáng)了其在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的功能。是一種理想的腫瘤特異性啟動(dòng)子。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步采用的第3代慢病毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng),研究了hTERT靶向性在腫瘤實(shí)時(shí)活體成像中的作用。比較腺病毒而言,該系統(tǒng)具有多種優(yōu)點(diǎn)[17-19]。能夠感染靜止細(xì)胞如腫瘤干細(xì)胞等;能夠?qū)⒛康幕蛘现了拗骷?xì)胞基因組從而達(dá)到長期表達(dá)的目的;較之第2代慢病毒,第3代包裝系統(tǒng)具有更高的生物安全性和更高的產(chǎn)物滴度[20]。RT-PCR檢測證實(shí)獲得的病毒滴度高達(dá)108級(jí),而且該慢病毒在2 MOI的感染倍數(shù)就能夠達(dá)到較高的感染效率,這些結(jié)果均顯示該病毒能夠滿足體外及在體實(shí)驗(yàn)的要求。本研究結(jié)果顯示,含hTERT啟動(dòng)子的慢性病毒能夠在端粒酶陽性細(xì)胞內(nèi)特異性地表達(dá)GFP蛋白,而在端粒酶陰性細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)GFP。同時(shí),GFP表達(dá)時(shí)間長達(dá)40 d之久,表明該病毒不僅具有嚴(yán)格的端粒酶特異性,而且能夠整合至宿主細(xì)胞基因組,長時(shí)表達(dá)目的基因。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,含優(yōu)化型hTERT啟動(dòng)子和報(bào)告基因GFP的慢病毒能夠通過瘤內(nèi)注射的方式感染活體腫瘤,在端粒酶陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)GFP,并且在小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)內(nèi)實(shí)時(shí)無創(chuàng)的檢測到熒光信號(hào)。從而研究腫瘤細(xì)胞的生長模式、轉(zhuǎn)移模式以及其他生物學(xué)行為。在該活體顯像模型中,hTERT靶向的慢病毒感染后,hTERT陽性腫瘤細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)隨著腫瘤生長而范圍增大,熒光強(qiáng)度升高,將有可能成為一種很有潛力的腫瘤診斷和示蹤工具。

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