酶法改性提高酸提米渣蛋白水溶性的研究

麥 波,錢俊青

(浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州 310032)

米渣中提取的大米蛋白主要成分是谷蛋白和醇溶蛋白這兩種貯藏性蛋白,由于其中谷蛋白的含量最高,占總量的80%以上,而谷蛋白分子量較大,分子內(nèi)和分子之間廣泛存在的二硫鍵以及分子內(nèi)存在的巰基,結(jié)構(gòu)決定其不溶于中性鹽溶液而只溶于稀酸、稀堿[1].醇溶蛋白富含谷氨酸、亮氨酸和丙氨酸殘基,賴氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸殘基含量很少,醇溶蛋白疏水性很強(qiáng)[2].米渣蛋白的這些特性大大限制了大米蛋白功能性開發(fā).以酶處理改善其性能,更好的適用于食品加工.A.Anderson[3]用Pronase酶處理大米蛋白后,進(jìn)行功能性評價(jià)發(fā)現(xiàn),處理后米蛋白在水中溶解性增加,適合于各種加工食品.因此,酶處理可獲得性能較好的大米改性蛋白.通過實(shí)驗(yàn)表明,隨著水解度的增加疏水性增加,然而其溶解度卻增大.但是由于通過酶的部分水解,會(huì)同時(shí)改變電荷頻率、疏水性和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),使這種相關(guān)性不再存在.電荷頻率的增加,使蛋白的溶解性上升,雖然包埋在內(nèi)部的疏水基團(tuán)有可能暴露,使疏水性增加,但總體上對大米蛋白水解物來講,其電荷頻率的影響要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于疏水性的影響[4].盡管疏水性有一定的增加,但其溶解性卻增加不少.總之,酶解能提高大米蛋白的功能性質(zhì),而且與蛋白質(zhì)的酸或堿水解相比較,酶水解的條件比較溫和,能更多地保留蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值,更重要的是酶水解過程易于控制,而且蛋白質(zhì)分子在酶的催化下有控制的水解,將蛋白質(zhì)分子中肽鍵打開,一般不會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)方面的損失,也不會(huì)產(chǎn)生毒理上的問題[5].

目前,我國大米蛋白主要還是用于食品行業(yè),特別是蛋白粉產(chǎn)品要求有良好的蛋白水溶性,本研究即針對以上開展研究,希望能在酸提取大米蛋白之后,利用中性蛋白酶改性大米蛋白,使其水溶性得到很好的改善,并能應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn),實(shí)現(xiàn)良好的經(jīng)濟(jì)效益.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

中性蛋白酶(食用)120 000 U/g無錫星達(dá)生物工程有限公司,大豆分離蛋白(蛋白含量80.3%),雙縮脲試劑、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等試劑(分析純).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

電子天平,臺(tái)式離心機(jī),紫外分光光度計(jì),噴霧干燥器,數(shù)控超級(jí)恒溫槽,組織搗碎機(jī),旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,酸度計(jì).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 米渣蛋白酸提取的方法

取米渣樣品10 kg,利用酸性水提取米蛋白[6],在最優(yōu)條件固液比1∶6,提取pH為1.0,提取溫度為95℃,提取時(shí)間為4 h,米蛋白最佳沉淀pH為4.0時(shí)提取,噴霧干燥得大米蛋白干粉,提取得米蛋白的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為85.1%,米蛋白的收率是90.7%.

1.3.2 酶改性提高水溶性的方法

取大米蛋白干粉,按固液比1∶5加水,調(diào)pH 4.0和 pH 5.0,分別在 12 000 r/min下離心10 min,用雙縮脲法測定上清液蛋白含量[7].加準(zhǔn)確量中性蛋白酶,水浴保溫酶解,再將酶解液調(diào)pH 4.0和 pH 5.0,分別在 12 000 r/min下離心 10 min,用雙縮脲法測定上清液蛋白含量,計(jì)算米蛋白水溶解量提高率(%),即

式中:P0為酶解前清液蛋白含量的測定值(mg/mL);P1為酶解后清液蛋白含量的測定值(mg/mL).

1.3.3 分析方法

蛋白含量測定用雙縮脲法,標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清白蛋白.經(jīng)計(jì)算得標(biāo)準(zhǔn)曲線為

1.3.4 酶改性提高水溶性的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)法

根據(jù)對影響大米蛋白水溶性的5個(gè)單因素(酶解溫度、酶解pH 值、固液比、加酶量和酶解時(shí)間)進(jìn)行考察,確定影響最大的4個(gè)因素,設(shè)計(jì)酶改性提高水溶性的L9(34)正交實(shí)驗(yàn)表,進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),確定酶改性提高水溶性適宜條件[8].

在超聲波檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)，樁周圍存有缺陷，樁身成形不完整。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因孔樁護(hù)壁不好，澆筑時(shí)出現(xiàn)坍塌，還有就是因?yàn)榛炷梁鸵仔圆缓?，不能很好的流?dòng)造成樁底沉淀物在澆筑上涌的過程中沒能順利上升，散落在樁周圍造成的。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶改性提高水溶性的單因素條件優(yōu)化

米渣酸提取的米蛋白加酶水解改性,酶解溫度、酶解pH值、酶用量、酶解時(shí)間及固液比均是改性效果的影響因素,為了減少操作帶來的誤差,在試驗(yàn)確定酶解影響因素時(shí)都采用同一批酸提取的蛋白.

以大米蛋白在pH 4.0和pH 5.0時(shí)的水溶性為指標(biāo),考察酶解各因素對大米蛋白水溶性的影響.選擇pH 4.0和pH 5.0時(shí)的蛋白水溶性作為考察指標(biāo),是因?yàn)閜H 4.0是大米蛋白等電點(diǎn),若通過酶解能有效提高等電點(diǎn)附近的蛋白水溶性,即說明酶改性提高水溶性在其他pH條件下更有效.

2.1.1 酶解溫度對提高大米蛋白水溶性的影響

米蛋白液調(diào)pH值為6.5,每100 g-米蛋白酶量30 U,固液比1∶6,水解1 h,測定水溶性的提高率,影響曲線見圖1.

圖1 酶解溫度對水溶性增加的影響Fig.1 Influence of enzymolysis temperature on solubility

由圖1所示結(jié)果可知,隨著酶解溫度的升高,大米蛋白的水溶性先升后降,在45℃時(shí)水溶性最高,這與溫度對酶反應(yīng)的影響作用有關(guān),45℃可能是中性蛋白酶在大米蛋白中的最適作用溫度.故正交時(shí)可選擇40℃,45℃,50℃考察.

2.1.2 酶解pH值對提高水溶性的影響

米蛋白液調(diào)pH值,每100 g-米蛋白酶量30 U,固液比1∶6,45℃水解1 h,測定水溶性的提高率,影響曲線見圖2.

圖2 酶解pH值對水溶性增加的影響Fig.2 Influence of pH value on solubility

由圖2可知,在酶解pH 7.0時(shí)蛋白水溶性最大,pH 6.0～pH 7.0之間上升趨勢,在pH 7.0～pH 8.5之間蛋白水溶性稍有下降但數(shù)值都比較接近,但考慮到應(yīng)用于食品加工,選擇中性進(jìn)行考察,即pH 6.0～pH 7.0區(qū)段.

2.1.3 固液比對提高水溶性的影響

米蛋白液調(diào)pH值7.0,每100 g-米蛋白酶量30 U,45℃水解1 h,測定水溶性的提高率,影響曲線見圖3.

由圖3所示結(jié)果可知,固液比影響曲線平滑,可見在試驗(yàn)的固液比范圍內(nèi)對大米蛋白水溶性提高的影響并不十分明顯,可選擇固液比1∶5,以降低生產(chǎn)成本.

圖3 固液比對提高水溶性的影響Fig.3 Influence of solid-to-liquid ratio on solubility

2.1.4 加酶量對提高水溶性的影響

米蛋白液調(diào)pH值7.0,固液比為1∶5,45℃水解1 h,試驗(yàn)加酶量,測定水溶性的提高率,影響曲線見圖4.

圖4 酶用量對提高水溶性的影響Fig.4 Influence of enzyme usage on solubility

從圖4可見,在每100 g-米蛋白酶量40 U時(shí),大米蛋白水溶解性最高,水解率分別為84.14%(pH 4.0時(shí)的蛋白液)和89.48%(pH 5.0時(shí)的蛋白液),同時(shí)與未經(jīng)酶改性的大米蛋白相比,水溶性大大提高.

2.1.5 酶解時(shí)間對提高水溶性的影響

米蛋白液調(diào)pH值7.0,每100 g-米蛋白酶量10 U,固液比為1∶5,45℃水解,測定水溶性的提高率,影響曲線見圖5.

圖5 酶解時(shí)間對提高水溶性的影響Fig .5 Inf luence of enzymolysis time on so lubility

由圖5可知,酶解液pH 4.0時(shí)的最適酶解時(shí)間為2.0 h,酶解液pH 5.0時(shí)的最適酶解時(shí)間為1.0 h,但從0.5 h至1.0 h效果基本相同,故在正交試驗(yàn)時(shí)可選擇酶解時(shí)間1.0～2.0 h.

2.2 酶改性提高水溶性的條件正交實(shí)驗(yàn)

選擇對酶改性提高水溶性影響較大的4個(gè)因素(酶用量、溫度、pH值和酶解時(shí)間)作 L9(34)正交實(shí)驗(yàn),正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示.

表1 酶解提高蛋白水溶性正交試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Result of orthogonal experiment on improving protein solubility

由表1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析可知,在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi),酶解時(shí)間和酶解溫度的影響是最為顯著的,而pH值的影響有一定影響,酶用量的影響最小,這可能是因?yàn)槊赣昧勘容^大,其影響就相對體現(xiàn)較小.由正交表的極差分析可知,酶改性提高大米蛋白水溶性的最適酶解條件為:每100 g-米蛋白酶量30 U,酶解溫度50℃,酶解pH 7.0,酶解時(shí)間2 h.酶用量的影響很小,結(jié)合單因素條件試驗(yàn)的結(jié)果,酶用量選為每100 g-米蛋白酶量40 U.

2.3 米渣酸法提取蛋白酶改性噴霧干燥制備大米蛋白粉

在酶改性提高蛋白水溶性的最優(yōu)條件下,酶解得到大米蛋白液,利用噴霧干燥器將大米蛋白液干燥,得到大米蛋白粉,其為米白色粉末,顆粒均勻,無味.將大米蛋白粉溶于水,測得混懸液中米蛋白水溶解率為65.5%,同樣試驗(yàn)大豆蛋白的水溶性,其水溶解率為62.7%.米渣酸法提取蛋白經(jīng)酶法改性,可替代大豆蛋白,成為高蛋白食品,也可用于各種食品加工的營養(yǎng)強(qiáng)化劑.

3 結(jié)論

采用中性蛋白酶對米渣酸提蛋白進(jìn)行酶法改性,研究改性提高蛋白水溶性的工藝,通過實(shí)驗(yàn)確定酶法改性的最適條件:每100 g-米蛋白酶量40 U,酶解溫度50℃,酶解pH 7.0,酶解時(shí)間2 h,固液比為1∶5.所得的高溶解性大米蛋白經(jīng)噴霧干燥處理,最終大米蛋白粉的溶解率為65.5%,和大豆蛋白相比,可替代其做為高蛋白食品,也可用于各種食品加工的營養(yǎng)強(qiáng)化劑.同時(shí),雖然已經(jīng)通過酶法改性,較好的提高了大米蛋白的水溶性,但也還存在需進(jìn)一步研究的地方,如噴霧干燥獲得蛋白粉的工藝,更有效地保持蛋白的高水溶性.

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