X射線對(duì)體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞損傷的初步實(shí)驗(yàn)研究

周 鋒 張三典

(江蘇省江陰市中醫(yī)院檢驗(yàn)科,214400)(江蘇蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院,215000)

近年來(lái),放射誘發(fā)的心臟操作性病變?nèi)找嬖龆?逐漸成為影響放射治療療效的重要因素之一。研究表明：人類(lèi)心臟受照小部分,心肌細(xì)胞可發(fā)生凋亡[1]。有學(xué)者認(rèn)為,盡管輻射誘發(fā)細(xì)胞損傷無(wú)論在體內(nèi)或體外均不是細(xì)胞殺傷的主要模式,但射線誘發(fā)的細(xì)胞損傷在體內(nèi)仍有一定作用[2]。細(xì)胞損傷在心臟的生理、病理發(fā)展過(guò)程中起著重要作用,被認(rèn)為是心臟由代償性變化向病理性變化發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)。由于心肌細(xì)胞的損傷,從而誘發(fā)了多種心血管系統(tǒng)疾病及臨床綜合癥的發(fā)生發(fā)展。國(guó)內(nèi)外許多文獻(xiàn)報(bào)道了放射與心肌細(xì)胞損傷的相關(guān)性研究,為進(jìn)一步研究放射對(duì)心肌細(xì)胞的影響,本文利用體外培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?通過(guò)不同放射劑量 X射線照射心肌細(xì)胞,利用全自動(dòng)生化分析儀定量測(cè)定心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的乳酸脫氫酶的含量變化,來(lái)評(píng)價(jià)放射誘發(fā)心肌細(xì)胞損傷程度,并從細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變進(jìn)一步評(píng)價(jià) X射線對(duì)心肌細(xì)胞的損傷,從而為探討 X射線對(duì)心臟損傷及其防護(hù)提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用出生 1天～ 3天的 Sp raque-Daw ley乳鼠,由蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑 乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒由日本一化公司提供;吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)試劑盒均為 Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 儀器

1.3.1 Heraeus二氧化碳培養(yǎng)箱 BB16/BB5060型：美國(guó) HERAEUS公司。

1.3.2 KD-2 6MV直線加速器：德國(guó)西門(mén)子公司。

1.3.3 OLYM PUS2700全自動(dòng)血生化分析儀：日本 OLYM PUS公司。

1.3.4 Leica TCSSP2激光掃描共聚焦顯微鏡系統(tǒng)M RC-1024型：Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 心肌細(xì)胞培養(yǎng) 出生 1天～ 3天的乳鼠(雌雄兼用),參照 Sadoshima[3]等介紹的方法。常規(guī)以碘酒、酒精消毒,剪開(kāi)胸腔,無(wú)菌條件取出心臟,放入無(wú)鈣鎂 PBS溶液中,剪去心房及主動(dòng)脈,將心室組織剪成 1mm～3mm碎片后,用 0.25%胰酶 37℃水浴消化 20min,收集細(xì)胞,打勻后吸出上層,反復(fù) 5次～ 6次?；鞈乙?2000r/min,離心 10min。棄上清液后用 DM EM洗滌,混懸液 2000r/min,離心 10min,棄上清液,加 DMEM培養(yǎng)液(含 20%小牛血清 )制成細(xì)胞懸液,置于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁后,用差速貼壁法,于 5%CO2,37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中,孵育90min,由于纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞更易于貼壁,用此法可使大部分纖維細(xì)胞貼壁[4],取富含心肌細(xì)胞的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

按此法培養(yǎng)的心肌細(xì)胞,于培養(yǎng)后 24h即可見(jiàn)部分細(xì)胞收縮,更換含 15%小牛血清的 DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),每 3天換培養(yǎng)液 1次,取第 4天的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1.4.2 心肌細(xì)胞的 X射線照射 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的心肌細(xì)胞,將貼壁心肌細(xì)胞消化制成細(xì)胞懸液,用DMEM培養(yǎng)基將細(xì)胞調(diào)至 3×105/m l,根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)平均分為 6組 (每組 4瓶),繼續(xù)培養(yǎng) 3天后,分別置入 5m l離心管,封管并標(biāo)明組別,至西門(mén)子 KD-2直線加速器下放射,采用 6MV-X線垂直照射,放射野面積 10cm×10cm大小,射野源皮距 100cm,劑量率輸出 DT200cGy/m in,分別以 10Gy、20Gy、30Gy、40Gy和 50Gy作用心肌細(xì)胞。正常心肌細(xì)胞對(duì)照組不照射。

1.4.3 照射后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)含量的檢測(cè) 將上述各實(shí)驗(yàn)組帶回實(shí)驗(yàn)室繼續(xù)培養(yǎng),對(duì)照組換無(wú)血清培養(yǎng)基,分別在換液后第24h收集各組心肌細(xì)胞上清液,用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶的含量。

1.4.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察放射后心肌細(xì)胞損傷 根據(jù)上述心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶含量的測(cè)定結(jié)果,選用 DT40Gy X射線組作為心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變模型,并設(shè)正常心肌細(xì)胞對(duì)照組,觀察第 24小時(shí)后心肌細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)改變。實(shí)驗(yàn)步驟如下：(1)各組細(xì)胞分別置入放有蓋玻片的 24孔培養(yǎng)板中,放入 37℃,5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h,待細(xì)胞爬片。 (2)吸去培養(yǎng)液,用 PBS液洗滌 2次,加入 1m l PBS;(3)分別加入終濃度為 5μg/m l吖啶橙(AO)和終濃度為 10μg/m l碘化丙啶(PI)孵育爬片細(xì)胞;(4)放入 37℃溫箱 30min染色;(5)取出爬有心肌細(xì)胞的蓋玻片反置于載波片上,至激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞并判斷。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng) DT40Gy輻射劑量照射心肌細(xì)胞后第 24小時(shí),用(AO/PI)雙染色法在激光掃描共聚焦顯微鏡下可觀察到典型的心肌細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)改變(如核固縮、核碎裂、胞內(nèi)空泡形成)。

2.2 不同放射劑量的 X射線對(duì)培養(yǎng)上清液中心肌細(xì)胞 LDH釋放量不同 心肌細(xì)胞有較高的輻射抗性,在單次大劑量放射 10Gy～ 30Gy時(shí),乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 LDH釋放量雖隨放射劑量的增大而增加,但 LDH釋放量變化不明顯(P＞ 0.05);當(dāng)放射劑量≥40Gy時(shí),心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 LDH釋放量顯著增加,統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示有意義(P＜0.05)。見(jiàn)附表。

3 討論

近年來(lái)隨著腫瘤放化療綜合治療的廣泛應(yīng)用和臨床療效的提高,某些腫瘤患者的生存期明顯延長(zhǎng),一些胸部腫瘤接受放療而引發(fā)的心臟放射損傷變得較為常見(jiàn),且日益引起人們的重視[5]。國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明,放射對(duì)心臟有直接的損傷作用。隨著分子生物學(xué)向放射醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的滲透,人們對(duì)輻射引起細(xì)胞損傷的認(rèn)識(shí)達(dá)到了一個(gè)新的高度。但目前對(duì)放射誘發(fā)心臟損傷機(jī)制還并不十分清楚。盡管在體內(nèi)乳酸脫氫酶主要存在于骨骼肌中,其次才是心臟,然而在離體培養(yǎng)心肌細(xì)胞內(nèi),LDH的活性卻反映了心肌細(xì)胞內(nèi)糖酵解產(chǎn)能和氧化磷酸化產(chǎn)能系統(tǒng)的功能狀態(tài)[6]。乳酸脫氫酶(LDH)是心肌細(xì)胞的胞漿酶。在正常情況下,LDH存在于細(xì)胞內(nèi),當(dāng)心肌細(xì)胞受到損傷后,細(xì)胞膜通透性增加,胞內(nèi)大量LDH漏出至細(xì)胞間隙和體液,而心肌細(xì)胞損傷后酶從胞漿中漏出與細(xì)胞膜的功能受損有關(guān)。故心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶含量,可作為評(píng)價(jià)心肌細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)之一。

附表 不同放射劑量下培養(yǎng)上清液中心肌細(xì)胞LDH釋放量

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,心肌細(xì)胞有較高的輻射抗性,在單次大劑量放射 10Gy～30Gy時(shí),乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 LDH釋放量雖隨放射劑量的增大而增加 (重復(fù) 2次),但 LDH釋放量變化不明顯 (P＞0.05);當(dāng)放射劑量≥40Gy時(shí),心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中 LDH釋放量顯著增加(重復(fù) 2次),統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示有意義(P＜0.05)。這提示我們放射線對(duì)心肌細(xì)胞有直接損傷作用。

AO[7]為一種活性染料,對(duì)活細(xì)胞及死細(xì)胞均能染色,PI[8]只對(duì)失去膜完整性的細(xì)胞染色。在共聚焦顯微鏡下,細(xì)胞核 DNA為黃色或黃綠色均勻熒光,細(xì)胞質(zhì)和核仁的 RNA為桔黃或桔紅色熒光。細(xì)胞受損傷時(shí),細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)致密濃染的黃綠色,甚或黃綠色碎片。細(xì)胞壞死時(shí),細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃綠色或桔黃色熒光減弱或消失。細(xì)胞損傷早期,細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)尚完整,陽(yáng)離子染料 PI無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞損傷晚期胞膜結(jié)構(gòu)被破壞,PI可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)使核染色質(zhì)著紅色。因此,同時(shí)使用這兩種熒光染料對(duì)細(xì)胞染色時(shí),僅有 AO著色的為早期損傷細(xì)胞,僅有 PI著色的為壞死細(xì)胞,兩種染料雙陰性者為正?；罴?xì)胞,雙陽(yáng)性者為繼發(fā)性壞死細(xì)胞。故早期損傷細(xì)胞呈致密濃染的黃綠色,由于染色質(zhì)凝聚及核裂解,細(xì)胞核中常有桔紅色斑點(diǎn)。晚期損傷細(xì)胞可被 AO染成致密濃染的黃綠色,甚至可見(jiàn)黃綠色碎片,其細(xì)胞核也常呈損傷的特征性變化。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng) DT40Gy放射劑量照射心肌細(xì)胞后第 24小時(shí),培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞發(fā)生明顯的細(xì)胞損傷的形態(tài)學(xué)改變(如脫核、核碎裂、胞質(zhì)空泡形成等)。

對(duì)放射誘導(dǎo)心肌細(xì)胞死亡的機(jī)制,一般認(rèn)為,放射線導(dǎo)致的細(xì)胞死亡是通過(guò)放射線的間接作用生成活性氧等有害基因而形成的。放射通過(guò)“直接作用”和“間接作用”產(chǎn)生大量自由基而殺傷細(xì)胞[9]。輻射誘發(fā)細(xì)胞損傷不但與細(xì)胞的輻射敏感性有關(guān)[10],而且與細(xì)胞類(lèi)型也有很大關(guān)系,輻射敏感細(xì)胞就比輻射抗性細(xì)胞易發(fā)生損傷。另外,細(xì)胞損傷與生物體的生理節(jié)律也有關(guān),即細(xì)胞周期各時(shí)相對(duì)射線引發(fā)的細(xì)胞損傷敏感性也不同。

由于實(shí)驗(yàn)條件及時(shí)間所限,未能分別從放射后不同時(shí)間點(diǎn)跟蹤檢測(cè)心肌細(xì)胞培養(yǎng)基中乳酸脫氫酶含量,從而更好地評(píng)價(jià)放射與心肌細(xì)胞損傷的關(guān)系,這還有待進(jìn)一步研究。

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