遼寧地區(qū)斑禿患者與HLA-A、HLA-B等位基因相關(guān)性研究

姜海燕，翟寧，李劍平，陳陽(yáng)，秦玉孝，張悅，程巖峰，楊帆，韓秀萍

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院皮膚科，沈陽(yáng) 110004；2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽(yáng) 110001；3.遼寧省血液中心，沈陽(yáng)110044；4.鐵嶺市中心血站，遼寧 鐵嶺 112000）

斑禿是一種常見(jiàn)的毛發(fā)疾病，發(fā)病原因尚不清楚，目前認(rèn)為可能與遺傳，情緒應(yīng)激，內(nèi)分泌失調(diào)，自身免疫等因素有關(guān)，其中遺傳因素可能起重要作用［1］。關(guān)于HLA-A、HLA-B等位基因與斑禿的相關(guān)性研究，國(guó)外報(bào)道較多，國(guó)內(nèi)少有此方面的報(bào)道。關(guān)于此方面的報(bào)道因種族不同，地域不同而有差異。為了探討HLA-A、HLA-B等位基因與遼寧地區(qū)斑禿患者的相關(guān)性，我們應(yīng)用LABTypeTMSSO技術(shù)（又稱(chēng)序列微珠綜合實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)）檢測(cè)了44例遼寧地區(qū)漢族斑禿患者和200例正常對(duì)照者的HLA-A、HLA-B等位基因頻率。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

斑禿患者44例，其中男性26例，女性18例，年

齡 3~57歲，平均（25.36±13.23）歲，病程 5 d~86個(gè)月，均為中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院皮膚性病門(mén)診確診的遼寧地區(qū)漢族斑禿患者，彼此間無(wú)血緣關(guān)系。正常對(duì)照組200例，為彼此間無(wú)血緣關(guān)系的遼寧籍漢族健康人。

1.2 血液采集與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的制備：靜脈抽取受檢者抗凝血2 ml，其中0.5 ml用于DNA制備，其余血液分裝每管0.5 ml后-80℃冷凍保存?zhèn)溆?。?yīng)用全血基因組DNA提取試劑盒（大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品）提取基因組DNA。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。（1）取EDTA抗凝血0.5 ml至1.5 ml離心管中，加入GenTLE SolutionⅠ0.5 ml，震蕩數(shù)秒后室溫放置10 min，12 000 r/min，離心 5 min。（2）除去溶液，加入GenTLE Solution Ⅱ 1ml，顛倒混合 2、3 次后，12 000 r/min離心 5 min。（3）除去上清，加入 GenTLESolution Ⅲ 0.5 ml，震蕩 10 s，12 000 r/min 離心 5 min。（4）將上清液移入新的離心管中，與等量的異丙醇混合，充分顛倒混合后，12 000 r/min 4℃離心5 min；（5）除去上清，70%乙醇清洗沉淀物，12 000 r/min 4℃離心5 min后干燥沉淀，用10μl TEBuffer溶解沉淀。（6）純化DNA。將制備的DNA濃度調(diào)為0.1μg/μl左右。DNA純度A260/A280比率在1.6~1.9。并用0.8%瓊脂糖凝膠電泳顯示無(wú)DNA降解現(xiàn)象。

1.2.2 HLA分型：HLA-A、HLA-B基因分型采用基于Luminex技術(shù)的One Lambda公司PCR-SSO試劑。嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。（1）等位基因擴(kuò)增：準(zhǔn)備PCR板，每孔加待測(cè)DNA 2μl，底物/組特異性引物/Taq聚合酶混合液9μl。PCR循環(huán)參數(shù)：96℃預(yù)變性3 min，96℃變性 20 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共計(jì)5個(gè)循環(huán)；96℃變性10 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。（2）變性及中和：準(zhǔn)備96孔板，每孔加擴(kuò)增后的DNA 2.5μl及變性緩沖液1.5μl，溫室下孵育10 min后加中和緩沖液2.5μl。（3）雜交：每孔加雜交緩沖液（內(nèi)含包被有SSO探針的磁珠，其中A位點(diǎn)79個(gè)探針，B位點(diǎn)86個(gè)探針）19μl，60℃孵育15 min后用洗滌液清洗3次。（4）標(biāo)記：每孔加熒光液25μl，60℃孵育5 min后用洗滌液清洗1次，加60 μl洗滌液，轉(zhuǎn)到Luminex讀板上。（5）讀板并確定基因型：雜交產(chǎn)物用Luminex100流式微珠自動(dòng)檢測(cè)儀進(jìn)行結(jié)果讀取和分析（流式分析儀，Luminex公司產(chǎn)品），確定基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件分析，采用卡方檢驗(yàn)對(duì)患者組和正常對(duì)照組的HLA等位基因進(jìn)行相關(guān)性分析，獲得χ2值及P值。

2 結(jié)果

2.1 斑禿患者組與正常對(duì)照組HLA-A等位基因頻率比較

斑禿患者組HLA-A*11等位基因頻率較正常對(duì)照組明顯增高（10.23%vs 4.00%，χ2=6.08，P=0.01），見(jiàn)表1。

表1 HLA-A等位基因在患者組與對(duì)照組中的頻率比較Tab.1 The comparison of HLA-A allele frequencies between the patients with alopecia areata and healthy control

2.2 斑禿患者組與正常對(duì)照組HLA-B等位基因頻率比較

斑禿患者組HLA-B*13（12.50%vs 1.25%，χ2=29.80，P=0.00）、HLA-B*40 （12.50%vs 4.75%，χ2=8.04，P=0.01）、HLA-B*46（5.68%vs 1.50%，χ2=5.86，P=0.02）和 HLA-B*51（12.50%vs 4.50%，χ2=8.82，P=0.00）等位基因頻率均較正常對(duì)照組顯著增高，見(jiàn)表2。

3 討論

斑禿的病因至今未明。大多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為它是細(xì)胞介導(dǎo)、基因調(diào)控的自身免疫性疾病。基因易患性似乎是一個(gè)病因，有人認(rèn)為斑禿可能與HLA基因相關(guān)［2］。關(guān)于斑禿與HLA相關(guān)性研究，國(guó)外在此方面的研究比較早。Kavak［3］報(bào)道土耳其斑禿患者HLAA1、HLA-B 62（15）等位基因頻率明顯增高。Aliaqaoqlu［4］研究發(fā)現(xiàn)土耳其斑禿患者HLA-B 62顯著增多，而 HLA-A*2、HLA-A*24、HLA-B*35 明顯減少，提示 HLA-A*2、HLA-A*24、HLA-B*35 可能是斑禿患者的保護(hù)性基因。McDonagh［5］報(bào)道以色列人與HLA-B18 相關(guān)。Hordinsk［6］和 Nanda［7］分別報(bào)道美國(guó)和科威特斑禿患者HLA-B*40等位基因頻率明顯增高，這與我們的研究結(jié)果相一致。

關(guān)于斑禿與HLA-A、HLA-B等位基因的相關(guān)性，國(guó)內(nèi)外的檢測(cè)結(jié)果不盡相同。國(guó)內(nèi)在此方面的研究多選擇不同省籍的漢族斑禿患者作為研究對(duì)象。2007年肖鳳麗等［8］發(fā)現(xiàn)皖籍漢族斑禿患者HLAA*02、HLA-A*03、HLA-B*18、HLA-B*27 和 HLA-B*52等位基因頻率較正常對(duì)照組顯著增高。其結(jié)果與國(guó)外報(bào)道部分相同，而與我們的結(jié)果無(wú)相同之處。

表2 HLA-B等位基因在患者組與對(duì)照組中的頻率比較Tab.2 The comparison of HLA-B allele frequencies between the patients with alopecia areata and healthy control

我 們 研 究 發(fā) 現(xiàn) HLA-A*11、HLA-B*13、HLAB*40、HLA-B*46和HLA-B*51等位基因頻率顯著增 高 。HLA-A*11、HLA-B*13、HLA-B*46 和 HLAB*51是我們新發(fā)現(xiàn)的易患基因位點(diǎn)，可能是遼寧地區(qū)漢族斑禿患者的易感基因。我們的研究結(jié)果與以往的研究有相同之處，說(shuō)明遺傳因素可能在斑禿的發(fā)病中起重要作用，而有差異則考慮可能是地域不同、種族不同所致。通過(guò)對(duì)斑禿患者與HLA-A、HLAB等位基因相關(guān)性的研究，將對(duì)揭示斑禿的發(fā)病機(jī)理及臨床早期診斷具有重要意義。

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