辛伐他汀對(duì)肺纖維化大鼠肺內(nèi)結(jié)締組織生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

馮彥華，肖莉，萬(wàn)宏光，杜妍，何穎

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院急診科，沈陽(yáng) 110004）

肺纖維化（pulmonary fibrosis）是以成纖維細(xì)胞異常增殖、細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積為特征的慢性、進(jìn)行性肺間質(zhì)疾病，被診斷后中位生存期只有2～5年，傳統(tǒng)的糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑治療效果并不明確［1］。肺纖維化的發(fā)病機(jī)理至今尚未明確，但已有研究顯示，多種細(xì)胞因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforminggrowth factor-β，TGF-β）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）、白細(xì)胞介素13、血小板源性生長(zhǎng)因子、干擾素γ等在肺纖維化的發(fā)病過(guò)程中起著非常重要的作用［2］，其中，CTGF作為一種重要的促纖維化性細(xì)胞因子，早已引起學(xué)術(shù)界的廣泛重視。有研究表明，過(guò)度表達(dá)的CTGF可以導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)輕度、一過(guò)性肺纖維化［3］。除此之外，Watts等［4］的研究證實(shí)，在CTGF促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化過(guò)程中需要信號(hào)分子RhoA的參與，而后者的轉(zhuǎn)錄后修飾需要膽固醇合成代謝的中間產(chǎn)物焦磷酸糖牛兒酯的存在，因此，膽固醇的合成受抑就有可能影響CTGF對(duì)成纖維細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)，進(jìn)而對(duì)肺纖維化進(jìn)程產(chǎn)生抑制作用。

他汀類藥物是3-羥-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl CoA reductase，HMG-CoA）的抑制劑，具有明顯的抑制膽固醇合成代謝的作用。近年來(lái)，陸續(xù)有學(xué)者對(duì)他汀類藥物的抗纖維化作用進(jìn)行了一些相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)辛伐他汀對(duì)肺成纖維細(xì)胞的預(yù)處理，不僅抑制了肺成纖維細(xì)胞RhoA活化、CTGF表達(dá)［5］，而且在一定程度上誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞凋亡［6］。在這些細(xì)胞學(xué)研究的基礎(chǔ)上，本研究建立了博來(lái)霉素氣管內(nèi)注射誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化模型，并對(duì)大鼠進(jìn)行辛伐他汀灌胃治療，通過(guò)病理組織學(xué)、生化學(xué)等方法觀察辛伐他汀對(duì)大鼠肺纖維化的治療作用，并通過(guò)免疫組化和光密度分析觀察辛伐他汀對(duì)纖維化大鼠肺組織CTGF表達(dá)所產(chǎn)生的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)雄性 Sprague-Dawley（SD）大鼠（180～210 g）由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，博來(lái)霉素（Bleomycin，BLM）系日本化藥株式會(huì)社產(chǎn)品，辛伐他?。ㄊ娼抵楹贾菽硸|公司出品。Massion染色試劑盒購(gòu)于廣州儷科公司，羥脯氨酸含量測(cè)定試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，CTGF抗體、生物素標(biāo)記二抗、SABC試劑盒和DAB顯色試劑盒均為博士德生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：SD大鼠60只，隨機(jī)分為 4組：鹽水對(duì)照組（control group）、模型組（model group）、辛伐他汀即刻治療組（immediately simvastatin group）和辛伐他汀7 d后治療組（delayed simvastatin group）。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：模型組、辛伐他汀即刻治療組和辛伐他汀7 d后治療組均于水合氯醛（10%，0.3 g/kg）腹腔麻醉后氣管內(nèi)一次性注射博來(lái)霉素5 mg/kg復(fù)制肺纖維化模型，鹽水對(duì)照組氣管內(nèi)注入等容積的生理鹽水。建模后當(dāng)日，辛伐他汀即刻治療組每日胃管內(nèi)注入辛伐他汀生理鹽水混懸液20 mg/kg；鹽水對(duì)照組、模型組每日胃管內(nèi)注入等容積的生理鹽水；辛伐他汀7 d后治療組于建模7 d內(nèi)每日胃管內(nèi)注入等容積的生理鹽水，7 d后改為每日胃管內(nèi)注入辛伐他汀生理鹽水混懸液20 mg/kg。各組動(dòng)物均于建模7 d、14 d和28 d后各處死5只，觀察肺組織病理學(xué)改變、羥脯氨酸含量變化以及肺組織CTGF的表達(dá)。

1.2.2 肺組織病理學(xué)觀察：取右肺下葉，4%中性福爾馬林固定后，按常規(guī)病理學(xué)方法脫水、包埋、切片、HE染色、Masson染色。

1.2.3 肺組織羥脯氨酸含量測(cè)定：按羥脯氨酸含量測(cè)定試劑盒的操作步驟，稱量左肺組織30~50 mg，加入水解液1 ml進(jìn)行樣本水解，之后加入pH甲液、乙液調(diào)節(jié)pH值至6.0～6.8，活性炭吸附后離心，提取上清液1ml后測(cè)定各樣本吸光度。

1.2.4 肺組織CTGF的表達(dá)：按博士德公司SABC免疫組化染色試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，用0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液進(jìn)行熱抗原修復(fù)，DAB顯色液顯色，陰性對(duì)照以PBS代替一抗。CTGF陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞漿內(nèi)有棕褐色顆粒沉積，陰性對(duì)照則無(wú)。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)無(wú)重疊400倍高倍視野，應(yīng)用NIS-Elements F2.30圖像采集軟件進(jìn)行圖像采集，NIS-Elements BR3.0圖像分析軟件計(jì)算平均光密度（mean optical density，MOD），以 MOD 作為 CTGF表達(dá)的半定量參數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料，以x±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，有顯著性差異者進(jìn)一步用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。P<0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異標(biāo)準(zhǔn)，P<0.01為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)極顯著差異標(biāo)準(zhǔn)。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 辛伐他汀對(duì)肺纖維化大鼠肺組織病理學(xué)改變的影響

2.1.1 肺組織HE染色：鹽水對(duì)照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔大小均勻、無(wú)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔無(wú)增厚，無(wú)明顯纖維組織增生。模型組大鼠7 d時(shí)肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間隔膠原纖維增生少見(jiàn)；14 d時(shí)肺泡腔內(nèi)炎性細(xì)胞明顯減少，間隔內(nèi)膠原纖維明顯增生；28 d時(shí)大量肺泡結(jié)構(gòu)破壞、萎陷，膠原纖維廣泛增生，偶見(jiàn)肺泡腔代償性擴(kuò)張。與模型組相比，辛伐他汀即刻治療組和辛伐他汀7 d后治療組7 d時(shí)病理表現(xiàn)差異不明顯；14 d時(shí)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較少，部分肺泡間隔纖維組織輕度增生；28 d時(shí)部分肺泡間隔內(nèi)膠原纖維增生，周圍可見(jiàn)較多量正常肺泡（圖1）。

2.1.2 肺組織Masson染色：鹽水對(duì)照組肺泡周圍可見(jiàn)少量藍(lán)染的膠原纖維。模型組大鼠14 d時(shí)膠原纖維明顯增生，28 d時(shí)可見(jiàn)藍(lán)染的膠原纖維廣泛大量增生，肺泡結(jié)構(gòu)破壞。辛伐他汀即刻治療組和辛伐他汀7 d后治療組膠原纖維輕-中度增生，較模型組增生程度明顯減輕（見(jiàn)圖2）。

2.2 辛伐他汀治療對(duì)肺纖維化大鼠肺組織羥脯氨酸含量的影響

氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素后，模型組大鼠肺組織羥脯氨酸含量逐漸增高，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在28 d時(shí)，辛伐他汀即刻治療組、辛伐他汀7 d后治療組肺組織羥脯氨酸含量，均明顯低于模型組并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示無(wú)論是辛伐他汀的即刻治療還是7 d后的延遲治療，均可對(duì)纖維化大鼠的肺組織膠原纖維形成產(chǎn)生有效的抑制作用（表1）。

2.3 辛伐他汀對(duì)肺纖維化大鼠肺組織CTGF表達(dá)的影響

CTGF的免疫組化和光密度分析結(jié)果顯示：氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素后，模型組大鼠肺組織CTGF的表達(dá)在7 d時(shí)達(dá)峰，并在之后的28 d內(nèi)維持在較高水平；在14 d、28 d時(shí)，辛伐他汀即刻治療組、辛伐他汀7 d后治療組肺組織CTGF表達(dá)，均明顯低于模型組并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示無(wú)論是辛伐他汀的即刻治療還是7 d后的延遲治療，均可對(duì)纖維化大鼠的肺組織CTGF表達(dá)產(chǎn)生有效的抑制作用（表1，圖3）。

表1 氣管內(nèi)滴注BLM后各組大鼠肺組織羥脯氨酸含量和CTGF平均光密度的變化（x±s）Tab.1 Changes of the hydroxyproline content and the MOD of CTGF in rat lungs after intratracheal BLM instillation（x±s）

3 討論

博來(lái)霉素氣管內(nèi)滴注復(fù)制的肺纖維化模型被認(rèn)為是研究肺纖維化的經(jīng)典模型，應(yīng)用最為廣泛［7］。氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素后，肺組織早期以肺泡炎為主，肺泡腔和肺泡間隔出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，大約在9 d左右［8］，肺泡炎開(kāi)始向纖維化轉(zhuǎn)變，并在3~4周后形成彌漫纖維化：肺泡結(jié)構(gòu)廣泛破壞、肺泡腔萎陷、甚至消失，肺泡間隔增寬，肺間質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量膠原纖維和成纖維細(xì)胞。本研究模型組大鼠的肺組織病理改變和羥脯氨酸含量測(cè)定結(jié)果與上述變化基本一致，標(biāo)志建模成功。

CTGF是一種富含半胱氨酸的多肽，分子量為38 kDa，于1991年在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的條件培養(yǎng)液中被發(fā)現(xiàn)［9］。CTGF可被TGF-β、凝血酶等多種促纖維化介質(zhì)所誘導(dǎo)，對(duì)于成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌起著非常重要的作用［10，11］。Lasky等［12］發(fā)現(xiàn)，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的纖維化肺組織中，CTGF的表達(dá)明顯增高。與此相一致的是，Allen等［13］在特發(fā)性肺纖維化患者的肺組織和支氣管肺泡灌洗液的細(xì)胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)表達(dá)異常增高的CTGF。本研究結(jié)果與此相似，氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素后，大鼠肺組織CTGF表達(dá)明顯增高，在1周左右達(dá)峰，之后持續(xù)高表達(dá)水平。

辛伐他汀是一種常用的他汀類降脂藥，作用肯定，療效安全。已有研究證實(shí)，辛伐他汀對(duì)肺成纖維細(xì)胞的預(yù)處理，不僅抑制了CTGF的基礎(chǔ)活性，也抑制了TGF-β對(duì)CTGF活性的誘導(dǎo)，該作用依賴于辛伐他汀對(duì)信號(hào)分子RhoA轉(zhuǎn)錄后修飾的抑制。Burke等［14］人的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1介導(dǎo)了成纖維細(xì)胞 Smad2/3的磷酸化、CTGF和膠原蛋白Iα-2的合成以及1型纖溶酶原激活物抑制物的激活，并最終誘導(dǎo)了成纖維細(xì)胞活化，而辛伐他汀對(duì)成纖維細(xì)胞的預(yù)處理，對(duì)TGF-β1所介導(dǎo)的上述多種致纖維化作用均產(chǎn)生有效抑制。本研究結(jié)果表明，氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素后對(duì)大鼠進(jìn)行辛伐他汀治療，抑制了纖維化肺組織CTGF的高表達(dá)，降低了肺組織羥脯氨酸含量，并改善了肺組織的纖維化病理改變。

除此之外，本研究尚證實(shí)了辛伐他汀的延遲治療作用。Moeller等［15］認(rèn)為，在博來(lái)霉素建模7 d內(nèi)進(jìn)行藥物治療，只能被稱為“預(yù)防性療法”；只有在博來(lái)霉素建模7 d后進(jìn)行藥物治療，才能被稱為“治療性療法”。這是因?yàn)榍罢叩摹翱估w維化”療效，有可能源于其對(duì)起始階段炎癥和早期纖維化反應(yīng)的干擾，而在肺纖維化反應(yīng)已經(jīng)始動(dòng)并進(jìn)行性加重階段，該種藥物能否緩解纖維化損害，仍存在疑問(wèn)。因此，“治療性療法”更具有研究?jī)r(jià)值。本研究提示，在博來(lái)霉素氣管內(nèi)滴注7 d后給藥，辛伐他汀仍能有效抑制纖維化肺組織CTGF的高表達(dá)，降低肺組織羥脯氨酸含量，改善肺組織的纖維化病理改變，進(jìn)一步肯定了辛伐他汀對(duì)肺纖維化的抑制作用。

總之，本研究結(jié)果顯示，在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化過(guò)程中，辛伐他汀有效抑制了肺組織CTGF高表達(dá)，改善肺組織纖維化程度，證實(shí)了辛伐他汀的延遲治療作用，為辛伐他汀治療肺纖維化提供新的理論依據(jù)。

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