多沙唑嗪光學異構(gòu)體對高血脂家兔血脂水平的影響*

曹雪濱，楊 梅，王榮英，任雷鳴

(1.河北醫(yī)科大學藥學院藥理學研究室，石家莊 050017;2.中國人民解放軍第二五二醫(yī)院心內(nèi)科，河北 保定 071000;3.河北醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院急診科，石家莊 050000)

多沙唑嗪(doxazosin，DOX)作為一種選擇性α1受體阻斷劑，不良反應少，安全性高，在國外已廣泛用于治療高血壓和良性前列腺增生癥，臨床使用其消旋體(甲磺酸消旋多沙唑嗪((±)doxazosin，(±)DOX))。動物實驗及臨床研究均證明(±)DOX可拮抗去甲腎上腺素(noradrenaline，NA)對血管平滑肌的收縮作用。但是，曾有報道指出(±)DOX可能誘發(fā)頭暈、血壓過低和昏厥等不良反應。為了減輕(±)DOX的不良反應，科研人員對其光學異構(gòu)體進行了研究。在DOX的分子中存在一個手性中心和一對光學異構(gòu)體(甲磺酸左旋多沙唑嗪((-)doxazosin，(-)DOX)、甲磺酸右旋多沙唑嗪((+)doxazosin，(+)DOX))。有研究發(fā)現(xiàn)在兔胸主動脈和頸總動脈等血管，(-)DOX拮抗NA誘發(fā)血管收縮的pA2值顯著小于(+)DOX，而兩者對動物膀胱排尿壓的作用相同，提示(-)DOX可能成為心血管副作用較小的治療BPH/LUTS藥物[1]。目前，國內(nèi)外相關(guān)研究已經(jīng)證實(±)DOX對患者的血脂產(chǎn)生有利影響[2]。但是，有關(guān)(±)DOX光學異構(gòu)體對血脂的影響，國內(nèi)外尚未見報道。本實驗研究擬觀察(±)DOX及其光學異構(gòu)體對高血脂家兔血脂水平及動物死亡率的影響。進一步為(±)DOX光學異構(gòu)體的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器、飼料、藥品與動物

普通級雄性新西蘭大耳白兔，體重1.5～2.5 kg，河北省實驗動物中心提供。飼養(yǎng)于中國人民解放軍第二五二醫(yī)院動物實驗中心(環(huán)境設(shè)施符合中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物二級標準)。高脂飼料組成:每100g普通兔飼料中含7.5 g蛋黃粉、1 g膽固醇和8 g豬油。日立7600-020全自動生物化學分析儀，日本日立公司制造;電子天平(JM10001)，余姚紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司;電子分析天平(FA2004)，上海良平儀器儀表有限公司;LDZ5-2型離心機，北京醫(yī)用離心機廠;可調(diào)定量移液器(5～50μl，50～ 100μl)，瑞士產(chǎn) ;TC 、TG 、HDL-C 、LDL-C 試劑盒:北京北化精細化學公司臨床試劑分廠生產(chǎn)。(-)DOX、(+)DOX和(±)DOX，由華北制藥集團新藥研發(fā)公司提供。

1.2 藥液配制

分別精確稱取一定量的(-)DOX、(+)DOX和(±)DOX干燥粉末，加適量無菌雙蒸水配制成1 mg/ml溶液。為了確保藥物完全溶解，以上三種藥物以無菌雙蒸水定容后均超聲20min;溶液儲存于棕色瓶中，置陰暗、干燥處保存?zhèn)溆?。?-4日配制1次。

1.3 動物分組

選取健康雄性新西蘭大耳白兔80只，隨機選取10只飼以普通飼料，另外70只飼以高脂飼料(每日每只家兔給予100g高脂飼料，補足普通飼料)。高脂飼料喂養(yǎng)前，耳緣靜脈取空腹血測血脂水平。高脂飼料喂養(yǎng)4周時，高脂飼料組家兔死亡22只。第4周末，由耳緣靜脈取空腹血測血脂水平。48只高脂飼料組家兔中，血清TC低于10mmol/L的實驗動物8只;其余40只家兔的血清TC水平超過 10mmol/L，可用于實驗[3]。按照血清TC水平的高低，將40只家兔隨機分為4組(n=10):高脂模型組、高脂模型+(-)DOX組、高脂模型+(+)DOX組以及高脂模型+(±)DOX組。普通飲食組10只動物存活良好，全部納入實驗。

1.4 動物飼養(yǎng)、給藥及體重測定

于高脂飼料喂養(yǎng)第5周開始，高脂模型+(-)DOX組、高脂模型+(+)DOX組以及高脂模型+(±)DOX組均腹腔注射給予相應的藥物(1.0mg/kg)，每日上午給藥 1次，給藥容積1 ml/kg，每周給藥7d，連續(xù)9周。普通飲食組和高脂模型組腹腔注射等容積無菌雙蒸水代替藥物。實驗期間動物單籠喂養(yǎng)，自由飲水。每周稱動物體重1次，根據(jù)新的體重調(diào)整給藥劑量。分別于實驗開始時(0周，高脂飼料喂養(yǎng)前)以及實驗開始(高脂飼料喂養(yǎng))后的第4周、7周、10周和13周末，由家兔耳緣靜脈取空腹血用于血脂測定。實驗結(jié)束時，動物禁食(不禁水)24h，以戊巴比妥鈉(25 mg/kg)麻醉家兔后，頸動脈放血處死動物。

1.5 實驗動物血脂測定

兔血樣標本直接采集于促凝生化管中，常溫靜置3 h，置4℃冰箱保存24h后，離心15 min，分離血清。使用日立7600-020全自動生物化學分析儀檢測血脂?？偰懝檀?TC，mmol/L)、甘油三脂(TG，mmol/L)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C，mmol/L)以及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C，mmol/L)的測定均采用酶法。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 (-)DOX、(+)DOX和(±)DOX對兔體重的影響

飼以高脂飲食前(0周)和給予(±)DOX及其光學異構(gòu)體之前(4周)，各組之間相比，家兔體重無顯著差別(表 1)。連續(xù)給藥3周、6周和9周時，各組之間相比，動物體重亦無顯著差別(表1)。

與飼以高脂飲食前相比時，普通飲食組在第4～13周、高脂模型組第7～13周、高脂模型+(+)DOX組第4～13周、高脂模型+(±)DOX組第10～13周，家兔體重顯著增長(P＜0.05和 P＜0.01);但是高脂模型+(-)DOX組動物體重無顯著增長(表1)。

Tab.1 Effects of doxazosin andits enantiomerson body weight of the rabbits fed by an atherogenic diet for 13weeks(kg，，n=6～ 10)

Tab.1 Effects of doxazosin andits enantiomerson body weight of the rabbits fed by an atherogenic diet for 13weeks(kg，，n=6～ 10)

Each rabbit at the beginning of experiments was fed a normal diet.Drug administrations began from the fifth week*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0week

Group Weeks 04710 13 Normal diet 1.98±0.30 2.55±0.45* 2.70±0.46** 2.79±0.43** 2.94±0.45**Atherogenic diet 2.03±0.23 2.35±0.36 2.44±0.35* 2.52±0.37* 2.75±0.40△△Atherogenic diet(-)Doxazosin 2.03±0.30 2.40±0.43 2.47±0.46 2.43±0.36 2.42±0.37(+)Doxazosin 2.00±0.13 2.55±0.48* 2.65±0.39** 2.67±0.48** 2.66±0.58**(±)Doxazosin 2.08±0.16 2.42±0.41 2.36±0.38 2.49±0.27* 2.61±0.29**

2.2 (-)DOX、(+)DOX和(±)DOX對兔死亡率的影響

在13周實驗過程中，普通飲食組家兔死亡1只，死亡率為10%;高脂模型組死亡4只，死亡率為40%;各給藥組的死亡率在10%～30%范圍內(nèi)。盡管各給藥組的動物死亡率與高脂模型組相比無統(tǒng)計學差異(P＞0.05，表2)，但是其各組的死亡率均低于高脂模型組，特別是高脂模型+(±)DOX組的死亡率與普通飲食組相同。

Tab.2 Effects of doxazosin and its enantiomers on survival rates of the rabbits fed by an atherogenic diet for 13weeks(n=10)

2.3 (-)DOX、(+)DOX和(±)DOX對兔血清脂質(zhì)水平的影響

2.3.1 血清TC的變化 飼以高脂飲食前，各組之間相比，家兔血清總膽固醇(total cholesterol，TC)無明顯差別(P＞0.05，表3)。與普通飲食組相比，給予(±)DOX及其光學異構(gòu)體之前以及連續(xù)給藥3周、6周和9周時，各給藥組血清TC含量明顯升高(P＜0.01，表3)。高脂模型+(-)DOX組、高脂模型+(+)DOX組以及高脂模型+(±)DOX組兔血清TC含量與高脂模型組相比，無顯著差別(表3)。

與給予(±)DOX及其光學異構(gòu)體之前相比，高脂模型組在第10～13周、高脂模型+(-)DOX組在第7～13周，家兔血清TC進一步顯著升高(P＜0.01，表3);但是高脂模型+(+)DOX組與高脂模型+(±)DOX組動物血清TC未進一步升高(表3)。

連續(xù)給藥3周、6周和9周時，各給藥組之間血清TC含量無顯著差別(表3)。

Tab.3 Effects of doxazosin and its enantiomers on serum total cholesterol levels in the rabbits fed by an atherogenic diet for 13 weeks(mmol/L，，n=6～ 10)

Tab.3 Effects of doxazosin and its enantiomers on serum total cholesterol levels in the rabbits fed by an atherogenic diet for 13 weeks(mmol/L，，n=6～ 10)

Each rabbit at the beginning(0week)of experimentswas fed by a normal diet.Drug administrations began from the fifth week**P＜0.01 vs atherogenic diet group;##P＜0.01 vs the values before drug administration(4 weeks)

Group Weeks 04710 13 Normal diet 1.41±0.27 1.53±0.38** 1.44±0.66** 0.98±0.60** 1.13±0.47**Atherogenic diet 1.73±0.57 28.63±7.65 35.26±7.88 41.16±4.11## 40.83±3.90##Atherogenic diet(-)Doxazosin 1.40±0.36 29.08±9.09 41.10±5.07## 40.16±4.38## 40.29±5.35##(+)Doxazosin 1.51±0.53 30.58±7.57 36.55±6.00 37.16±4.74 37.45±8.80(±)Doxazosin 1.24±0.45 29.36±7.94 35.58±11.58 38.41±6.84 37.59±6.09

2.3.2 血清TG的變化 飼以高脂飲食前，各組之間相比，家兔血清甘油三脂(triglyceride，TG)無明顯差別(P＞0.05，表4)。與普通飲食組相比，給予(±)DOX及其光學異構(gòu)體之前以及連續(xù)給藥3周、6周和9周時，各給藥組血清TG含量明顯升高(P＜0.01，表4)。各給藥組兔血清TG含量與高脂模型組相比，無顯著差別(P＞0.05，表4)。

與給予(±)DOX及其光學異構(gòu)體之前相比，普通飲食組家兔在第7～13周血清TG顯著降低(P＜0.05和 P＜0.01，表4);但是，其他各組兔血清TG含量無顯著變化(P＞0.05，表4)。

連續(xù)給藥3周、6周和9周時，各給藥組之間血清TG含量無顯著差別(P＞0.05，表4)。

Tab.4 Effects of doxazosin and its enantiomers on serum triglyceride levels in the rabbits fed by an atherogenic diet for 13 weeks(mmol/L，，n=6～ 10)

Tab.4 Effects of doxazosin and its enantiomers on serum triglyceride levels in the rabbits fed by an atherogenic diet for 13 weeks(mmol/L，，n=6～ 10)

Each rabbit at the beginning(0week)of experimentswas fed by a normal diet.Drug administrations began from the fifth week*P＜0.05，**P＜0.01 vs atherogenic diet group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs the values before drug administration(4 weeks)

Group Weeks 04710 13 Normal diet 1.86±0.81 1.25±0.29* 0.78±0.51**# 0.55±0.28**## 0.75±0.32**##Atherogenic diet 1.76±0.81 3.87±2.49 3.87±1.08 4.67±2.97 5.71±2.50Atherogenic diet(-)Doxazosin 1.70±0.99 5.24±3.87 5.27±2.06 5.79±3.75 5.16±2.86(+)Doxazosin 1.34±0.42 3.52±1.76 3.60±1.07 4.20±1.52 4.39±2.87(±)Doxazosin 1.87±0.56 4.10±2.43 3.60±2.06 3.95±1.42 4.88±1.91

2.3.3 血清HDL-C的變化 飼以高脂飲食前以及給予(±)DOX和兩個光學異構(gòu)體后，家兔血清高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)含量變化的組間比較結(jié)果與家兔血清TG變化的趨勢相同。

與給予(±)DOX及其光學異構(gòu)體之前相比，除(±)DOX連續(xù)給藥第6周末的血清HDL-C呈顯著下降外(P＜0.05，表5)，其他各組動物的血清HDLC變化趨勢與血清TG的變化相同。

連續(xù)給藥3周、6周和9周時，各給藥組之間血清HDL-C含量無顯著差別(P＞0.05，表5)。

Tab.5 Effects of doxazosin and its enantiomers on serum HDL cholesterol levels in the rabbits fed by an atherogenic diet for 13 weeks(mmol/L，，n=6～ 10)

Tab.5 Effects of doxazosin and its enantiomers on serum HDL cholesterol levels in the rabbits fed by an atherogenic diet for 13 weeks(mmol/L，，n=6～ 10)

Each rabbit at the beginning(0week)of experimentswas fed by a normal diet.Drug administrations began from the fifth week**P＜0.01 vs atherogenic diet group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs the values before drug administration(4weeks)

Group Weeks 04710 13 Normal diet 0.41±0.12 0.56±0.21** 0.16±0.08**## 0.17±0.09**## 0.15±0.07**##Atherogenic diet 0.39±0.20 2.78±1.11 2.54±0.66 2.11±0.87 2.02±0.45 Atherogenic diet(-)Doxazosin 0.39±0.16 2.90±0.84 2.48±0.32 2.19±0.49 2.18±0.61(+)Doxazosin 0.46±0.20 3.15±0.95 2.41±1.03 2.04±0.80 2.26±0.58(±)Doxazosin 0.35±0.20 2.86±1.06 2.07±0.61 1.81±0.53# 2.32±0.78

2.3.4 血清LDL-C的變化 飼以高脂飲食前以及給予(±)DOX和兩個光學異構(gòu)體后，動物血清低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)含量變化的組間比較結(jié)果與血清TG變化的趨勢相同。

與給予(±)DOX及其光學異構(gòu)體之前相比，普通飲食組家兔在第7～13周血清LDL-C水平顯著降低(P＜0.01，表6);高脂模型組在第7～13周、高脂模型+(±)DOX組在第10周血清LDL-C顯著升高(P＜0.05和 P＜0.01，表 6);但是，高脂模型+(-)DOX組以及高脂模型+(+)DOX組動物血清LDL-C含量無顯著改變(P＞0.05，表6)。

連續(xù)給藥3周、6周和9周時，各給藥組之間血清LDL-C含量無顯著差別(P＞0.05，表6)。

Tab.6 Effects of doxazosin and its enantiomers on serum LDL cholesterol levels in the rabbits fed by an atherogenic diet for 13 weeks(mmol/L，，n=6～ 10)

Tab.6 Effects of doxazosin and its enantiomers on serum LDL cholesterol levels in the rabbits fed by an atherogenic diet for 13 weeks(mmol/L，，n=6～ 10)

Each rabbit at the beginning(0week)of experimentswas fed by a normal diet.Drug administrations began from the fifth week**P＜0.01 vs atherogenic diet group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs the values before drug administration(4weeks)

Group Weeks 04710 13 Normal diet 0.52±0.21 0.74±0.34** 0.23±0.16**## 0.24±0.12**## 0.23±0.14**##Atherogenic diet 0.74±0.38 16.21±9.59 24.64±8.55# 25.39±4.19# 28.46±3.81##Atherogenic diet(-)Doxazosin 0.46±0.23 19.74±8.01 21.14±2.89 26.62±4.08 25.50±8.31(+)Doxazosin 0.71±0.38 19.71±8.35 20.81±4.65 24.08±6.49 23.88±5.87(±)Doxazosin 0.67±0.29 17.66±8.84 18.45±8.21 26.93±6.38# 25.50±6.70

3 討論

目前，國內(nèi)外相關(guān)研究已經(jīng)證實(±)DOX可以對血脂產(chǎn)生有利影響[2]。(±)DOX能夠有效降低血壓，同時對血脂和血糖代謝也產(chǎn)生良好影響。對于合并脂質(zhì)代謝障礙的高血壓病患者，具有降低血壓和改善血脂水平的雙重效應。Hoogerbrugge等[4]報道，高血壓伴高TC血癥患者連續(xù)服用(±)DOX 3年，患者血清TG和LDL-C水平分別顯著下降了13.7%和 30.1%，HDL-C水平則提高了25.7%;但是，雙氫克尿噻組患者的血脂水平無顯著性改變。最近，一項入組萬余名患者的大規(guī)模心臟事件臨床試驗研究結(jié)果顯示，(±)DOX作為三線抗高血壓藥物安全有效，同時具有輕度的降低血清TC、LDL-C和TG水平的作用[5]。

國外學者探索了(±)DOX改善血脂水平的作用機制。LDL的分解主要在肝外實質(zhì)細胞中進行，細胞表面有LDL受體，LDL通過它的載脂蛋白 B(apolipoprotein B，Apo B)精氨酸殘基與此受體結(jié)合。人體內(nèi)每天降解的LDL為總量的45%，其中約有三分之二是通過LDL受體途徑代謝。研究證實，在體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細胞實驗中，(±)DOX在10μmol/L具有增強LDL受體活性的作用[6]。在高膽固醇飼養(yǎng)的雄性倉鼠試驗中，(±)DOX給藥1周后，血漿膽固醇和肝臟膽固醇含量分別減少了12%和30%;同時發(fā)現(xiàn)，肝臟De novo膽固醇合成路徑的膽固醇合成減少了39%;作者認為，(±)DOX可能通過抑制肝臟膽固醇合成而降低血漿膽固醇水平[7]。脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)是水解乳糜微粒(chylomicra，CM)和VLDL-C的關(guān)鍵酶，載脂蛋白CII(apolipoprotein CII，Apo CII)是LPL的輔酶;CM獲得Apo C后可使LPL激活。有文獻報道(±)DOX尚具有激活LPL的作用[8]。

(±)DOX對高血脂模型動物的研究報道較少。Wilson等[2]在高脂飼養(yǎng)的倉鼠動脈粥樣硬化模型，用摻食法給予(±)DOX每日20mg/kg連續(xù)給藥6個月。模型組倉鼠的血漿TC、TG、LDL-C和HDL-C水平顯著升高;(±)DOX治療組的血漿TC、TG和LDL-C水平顯著降低，并能顯著抑制主動脈脂質(zhì)條紋的形成。國內(nèi)曹俊杰等[9]采用高膽固醇飼養(yǎng)的兔高血脂模型，研究了連續(xù)28 d口服給予(±)DOX 4 mg/d的治療作用，(±)DOX使兔血清TC水平明顯降低，HDL-C水平明顯升高。然而，Swindell等[10]連續(xù)9周口服給予(±)DOX 5 mg/d，對高血脂模型兔的血脂水平無任何影響。

本實驗中，我們亦觀察到與Swindell等[10]相似的研究結(jié)果。與高脂飲食對照組相比，(±)DOX連續(xù)腹腔注射給藥3周、6周和9周對高血脂家兔的血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平無顯著影響;(-)DOX和(+)DOX的作用與(±)DOX相同。但是，當以給藥前(高脂飼養(yǎng)第4周末)的高血脂參數(shù)作為對照組時，模型組家兔隨高脂飼養(yǎng)的時間延長，血清TC和LDL-C水平進一步顯著升高;而(-)DOX、(+)DOX和(±)DOX處理組動物的血清LDL-C水平未顯著升高，(+)DOX和(±)DOX處理組動物的血清TC水平亦未顯著升高。研究結(jié)果提示，(-)DOX、(+)DOX和(±)DOX對高血脂家兔血清TC和LDLC紊亂具有輕度的改善作用。同時，我們的實驗結(jié)果也表明，對于DOX改善人類血脂紊亂的研究而言，餌食性高血脂家兔可能不是理想的實驗模型。實驗中還發(fā)現(xiàn)，高脂模型組動物的死亡率較高，飼以高脂飲食13周時的死亡率可達40%，遠遠高于普通飲食組家兔(10%)。(±)DOX給藥組家兔的存活率與普通飲食組相同，(-)DOX亦可提高高脂飲食家兔的生存率。此外，盡管(+)DOX改善家兔血脂紊亂的作用略優(yōu)于(-)DOX，但是(+)DOX對高脂飲食誘發(fā)家兔死亡似乎沒有明顯的保護效果。實驗中，我們注意到普通飲食組家兔在3個月的飼養(yǎng)過程中，體重顯著增長;同時，血清 TC、TG、HDL-C 和LDL-C水平隨著飼養(yǎng)時間延長出現(xiàn)輕度但顯著的降低。為了控制檢測質(zhì)量，我們在每批樣品的測定過程中遵循單盲和隨機化原則;每次測定過程中均隨行建立標準曲線。正常家兔血清TC、TG、HDL-C和LDL-C水平隨著飼養(yǎng)時間延長出現(xiàn)輕度下降的現(xiàn)象尚未見報道，其生理學意義有待探討。

本研究結(jié)果提示，(-)DOX和(±)DOX可提高高脂飲食家兔的生存率，并對高血脂家兔的血清LDL-C紊亂具有輕度的改善作用。然而，(-)DOX和(±)DOX輕度改善家兔血脂紊亂的作用可能不是其提高高脂飲食家兔生存率的主要作用機制。

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